Molecular Cloning and Functional Analysis of Magnesium Protoporphyrin Ⅸ Methyltransferase Gene in Tissue Culture Seedlings of Cymbidium goeringii

供试材料为春兰‘宋梅’组培苗，保存在四川省农业科学院园艺研究所组培室（见图1）。

Figure 1.  Tissue culture seedling of Cymbidium goeringii. ‘Songmei’

根据天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒说明书，从叶片样品中提取总RNA，利用Nanodrop2000（Thermo Scientific，美国）对RNA的浓度和纯度进行检测，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。

使用Aidlab公司反转录试剂盒（TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行cDNA的合成，反应体系为40 μL：500 ng总RNA，8 μL 5×RT Reaction Mix，2 μL Oligo（dT）引物，2 μL TUREscript H- RTase/RI Mix，采用RNase Free dH2O补足至40 μL。反转录反应程序条件为：42 ℃ 60 min，65 ℃ 10 min。反应结束后，将得到的cDNA放置−20℃保存，用前稀释10倍使用。

根据表1的引物，从‘宋梅’cDNA中克隆了ClChlM1基因。PCR扩增程序：96 ℃ 10 min；96℃ 30 s；60 ℃ 30 secs，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。将扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶分离后对目的片段进行切胶回收，连入pMT18-T载体并转化大肠杆菌DH10B过夜培养。次日挑选克隆经菌落PCR验证后送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。

选取铁皮石斛的DcChlM1、马蹄蝴蝶兰的PeChlM1、油棕的EgChlM1、深圳拟兰的AsChlM1、风铃木的HiChlM1、香蕉的MaChlM1、玉米的ZmChlM1、柑橘的CsChlM1、黄麻的CoChlM1，以及春兰的ClChlM1，采用MEGA 5.0构建系统进化树。

设计酶切引物对ClChlM1基因进行扩增，将扩增后的片段经XhoI和SalI双酶切后连入pBI121-GFP载体，并对拟南芥原生质体进行转化。通过荧光显微镜（Olympus BX51）观察融合蛋白的定位。

为了获得ClChlM1过量表达载体，将ClChlM1编码区序列插入pART-CAM，获得pART-ClChlM1载体^[8]。通过农杆菌介导法将载体导入到本氏烟草中^[9]。表1引物检测烟草的阳性转化率。

按照Alawady and Grimm的方法检测ALA^[4]。取烟草叶片，在含有40 mM乙酰丙酸（pH 6.9）的20 mM磷酸盐缓冲液（pH值7.5）中，置于光下培养4小时。取上清液，加入乙酰乙酸煮沸10分钟。加入等量的Ehrlich’s试剂，在553 nm下检测ALA。

检测烟草的叶绿素含量，用95%的乙醇和稀释的丙酮碾磨叶片。用紫外分光光度计检测665 nm, 649 nm 和 470 nm波长^[10]。

引物序列详见表1。ACTIN基因作为内参，通过2^−△△Ct法对目的基因表达量进行计算。

通过RT-PCR获得了ClChlM1的开放阅读框（ORF）。DNA测序结果显示，ClChlM1的ORF长度为945 bp，编码314个氨基酸残基组成的蛋白质（见图2）。将ClChlM1序列提交至NCBI，序列号为MG574594。

Figure 2.  Nucleotide and deduced amino acid sequences of ClChlM1 from Cymbidium goeringii. ‘Songmei’

选取春兰的ClChlM1、铁皮石斛的DcChlM1、深圳拟兰的AsChlM1、油棕的EgChlM1进行氨基酸序列比对，结果表明春兰的ClChlM与其余四种有较高的同源性，且都含有守的Mg-por_mtran_C区域（见图3 A）。

Figure 3.  Phylogenetic and alignment of ClChlM1 with homologous proteins from other plants

为进一步分析ClChlM进化关系，选取铁皮石斛的DcChlM1、马蹄蝴蝶兰的PeChlM1、油棕的EgChlM1、深圳拟兰的AsChlM1、风铃木的HiChlM1、香蕉的MaChlM1、玉米的ZmChlM1、柑橘的CsChlM1、黄麻的CoChlM1蛋白序列进行进化树构建，结果显示植物ChlM蛋白分为三个亚类，其中ClChlM与DcChlM1、PeChlM1、AsChlM1、EgChlM1、MaChlM1属于第I亚类，且与DcChlM1亲缘关系最近（见图3 B）。

原生质体转化结果显示ClChlM1-GFP融合蛋白绿色荧光与叶绿体探针红色荧光融合为黄色荧光，表明ClChlM1定位于叶绿体（见图4）。

Figure 4.  Subcellular location of ClChlM1 in Arabidopsis protoplast

为进一步验证ClChlM1基因的功能，采用叶盘法将其转化到烟草中（见图5）。经PCR检测，获得三个转基因株系（见图5E）。

Figure 5.  Tobacco ClChlM1 transgenic

叶绿素是一种含卟啉化合物，ALA是卟啉生物合成过程中的一个重要前体。测定结果显示转基因株系中ALA合成效率显著高于对照株系，约为对照株系中的2.28倍（见图6）。

Figure 6.  Efficiency of ALA Synthesis in Transgenic Strains

叶绿素含量测定结果显示转基因株系中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量含量远高于对照株系，分别是对照株系的1.32倍、1.56倍、1.35倍（见图7）。

Figure 7.  Chlorophyll content in transgenic lines

进一步对光合作用相关成员谷氨酰tRNA还原酶 （HemA）, 谷氨酸酯-1-半醛2,1-氨基变位酶 （Gsa）, 叶绿素a/b结合蛋白（LHCB）, 镁离子螯合酶CHLI和镁离子螯合酶CHLH在转基因烟草中的表达模式进行分析，结果显示除了ClHemA外，ClGsa、ClLHCB、ClCHLI、ClCHLH在转基因株系中的表达量均显著高于对照组（见图8）。

Figure 8.  RT-PCR analysis of related genes

从春兰组培苗中克隆的ClChlM1基因ORF长度为945 bp，氨基酸序列分析显示ClChlM1拥有植物ChlM蛋白高度保守的Mg-por_mtran_C结构域，进化树分析显示ClChlM1与同为兰科植物的铁皮石斛的DcChlM1亲缘关系最近。

高等植物叶绿素生物合成属于典型的卟啉代谢途径，由谷氨肽-tRNA到叶绿素a和叶绿素b的形成共需经历十余步酶促反应，其中催化镁原卟啉Ⅸ（MgP）形成镁原卟啉Ⅸ单甲醚（MgPME）的ChlM是该过程关键酶之一^[12]。最近还有研究表明ChlM可以在转录后水平对光合作用编码蛋白进行调控。LHCB是捕光天线蛋白，位于叶绿体类囊体膜上，作用是将吸收的光能传递到作用中心，启动光合作用。在大麦中，Gadjieva等发现ChlM产物MgPME的积累会促进LHCB基因的表达^[13-14]。在本研究中，除了ClLHCB外，还发现ClGsa, ClCHLI和ClCHLH在ClChlM1过表达植株中显著上调，而ClHemA基因的表达量则无变化。HemA编码谷氨肽-tRNA还原酶，是叶绿素生物合成途径第一个酶；Gsa编码的谷氨酸-1-半醛转氨酶是叶绿素生物合成途径第二个酶，主要负责ALA的合成；CHLI和CHLH编码的蛋白是镁螯合酶的不同亚基，主要负责镁原卟啉IX的合成。因此，推测ClChlM1可反馈调节叶绿素的生物合成，具体的调控机制将是下一步研究重点。