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百合是百合科百合属多年生球根花卉,是世界重要的切花,具有极高的观赏价值和经济价值。近些年来,东方百合‘Vivian’凭借其花大色艳,深受消费者喜欢,种植面积逐年提高,市场对其种球的需求也与日俱增。
分球繁殖和鳞片扦插是百合种球生产的常见方式,但普遍存在繁殖系数较低[1-3]以及病毒(CMV、LMoV和LSV等)、真细菌性病害(灰霉病、枯萎病等)和虫害(蚜虫、线虫等)发生严重导致种性退化等问题[4-6]。离体快繁技术因其繁殖系数高,而且通过茎尖脱毒可以获得无病毒植株等优点[7-9],已成功应用于百合‘黄天霸’、‘水晶布兰卡’和‘Strawberry and Cream’等品种的种球繁育[10-15]、欧洲百合、金黄花滇百合、宜昌百合和新疆百合等野生百合资源保存[2-4, 16]以及百合新品种培育研究中。本研究以东方百合‘Vivian’的鳞片为外植体,在本实验室已有的离体快繁体系的基础,对不定芽的诱导、增殖、小鳞茎膨大、生根等步骤进行系统研究,旨在建立更为高效的东方百合‘Vivian’离体快繁体系,为其种球的规模化生产提供技术保障。
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东方百合‘Vivian’无菌组培苗为本实验室保存。
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基本培养基为MS或1/2 MS培养基。所有培养基的pH为6.0,琼脂浓度为6.0 g·L−1,121 ℃高压灭菌20 min冷却备用,培养温度为25 ℃。
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基于实验室前期的不定芽诱导配方(MS+0.5 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA+30 g·L−1蔗糖+6.0 g·L−1琼脂,pH值=6.0)设置不同激素和浓度组合6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L−1)、NAA(0.1、0.2 mg·L−1)的不定芽诱导培养基。将鳞片切成1 cm×1 cm的方块接种在各个不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导。45 d后观察统计不定芽诱导情况。每个处理30个鳞片,生物重复3次。
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基于实验室前期的增殖培养基配方(MS+1.0 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA+60 g·L−1蔗糖+6.0 g·L−1琼脂,pH值=6.0)设置不同激素和浓度组合6-BA(0.8、1.0、1.2 mg·L−1)、NAA(0.1、0.15 mg·L−1)的增殖培养基。待诱导出的不定芽长至直径1 cm左右后,将不定芽分别接种至不同的增殖培养基中进行增殖。45 d后观察统计不定芽增殖情况。每个处理30个不定芽,生物重复3次。
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将直径1 cm左右的小鳞茎转接至表3不同浓度蔗糖的培养基中进行小鳞茎的膨大培养,30 d转接一次,60 d后统计鳞茎的直径。
基本培养基 蔗糖/(g·L−1) 直径/cm MS 30 0.91±0.08c 60 1.43±0.14b 90 1.95±0.21a 120 1.33±0.23b Table 3. Effecdts of different concentrations of sucrose on bulblet enlargement
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将直径2~3 cm的鳞茎转接至表4的不同生根培养基中(蔗糖浓度为60 g·L−1),20 d后观察统计根系生长情况。
基本培养基 NAA/(mg·L−1) 生根系数 1/2MS 0.0 1.22±0.78d 0.1 2.76±1.31c 0.2 3.62±1.10b 0.3 4.63±0.39a 0.4 2.92±1.11c Table 4. Effecdts of different concentrations of NAA on rooting
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待鳞茎根长到2 cm左右,在温室中开瓶炼苗3~5 d,将组培苗从瓶中移出,洗净根系附着的琼脂,移入表5不同草炭与蛭石比例的基质中,保持70~75%左右湿度,60 d后观察生长情况并统计成活率。
基质 成活率/% 草炭∶蛭石(2∶1) 71.12±4.12b 草炭∶蛭石(1∶1) 95.31±1.21a 草炭∶蛭石(1∶2) 67.21±4.14c Table 5. Effecdts of different media on the survival of plantlets
1.1. 试验材料
1.2. 试验条件
1.3. 试验方法
1.3.1. 不定芽的诱导
1.3.2. 不定芽的增殖
1.3.3. 小鳞茎的膨大
1.3.4. 鳞茎的生根培养
1.3.5. 炼苗与移栽
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外植体在分化培养基上大概6~8 d开始进行分化,鳞片表面出现凸起,20 d左右逐渐分化出不定芽,随后逐渐发育成小鳞茎,如表1和图1A可知,当NAA的浓度不变时,不定芽诱导系数随着6-BA的浓度的升高呈现先升高后下降的趋势,当6-BA为1.0 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1时,不定芽分化的诱导系数为3.65,比实验室已有的不定芽诱导体系(6-BA为0.5 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1)的诱导系数1.01高出了2.64,此浓度组合的诱导率最高并且不定芽健壮,因此,此激素浓度组合的培养基为最佳不定芽诱导培养基。
基本培养基 6-BA/(mg·L−1) NAA/(mg·L−1) 诱导系数 MS 0.5 0.1 1.01±0.43d 0.5 0.2 1.83±1.14c 1.0 0.1 3.65±0.31a 1.0 0.2 2.63±0.02b 1.5 0.1 2.34±0.04b 1.5 0.2 1.32±0.23d Table 1. Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on adventitious bud induction
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将不定芽转接到不同增殖培养基后约7~9 d,在鳞茎基部出现不同数量的小的不定芽,随后逐渐长成新的小鳞茎。由表2和图1B可知,不同激素组合培养基中,不定芽的增殖情况差异较大,当6-BA为0.8 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1时,增殖系数为1.21,增殖情况最差;当6-BA为1.0 mg·L−1、NAA为0.15 mg·L−1时,增殖效果最好,增殖系数为4.63,比比实验室已有的不定芽增殖体系(6-BA为0.5 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1)的诱导系数3.21高出了1.42,因此,此激素浓度组合的培养基为最佳不定芽增殖激素培养基。
基本培养基 6-BA/(mg·L−1) NAA/(mg·L−1) 增殖系数 MS 0.8 0.1 1.21±1.31d 0.8 0.15 2.53±2.12c 1.0 0.1 3.21±1.23b 1.0 0.15 4.63±0.21a 1.2 0.1 3.34±1.31b 1.2 0.15 1.16±0.21d Table 2. Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on adventitious bud proliferation
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如表3和图1C所示,在蔗糖浓度为30~90 mg·L−1时,随着蔗糖浓度的不断提高,不定芽的膨大的越明显。当蔗糖浓度为90 mg·L−1时,鳞茎膨大最明显,而当蔗糖浓度为120 mg·L−1时,不定芽的膨大速度开始下降。
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将鳞茎接种至不同浓度的生根培养基中3 d左右开始从鳞茎基本生长出根。如表4和图1D所示,呈现出低浓度NAA促进根的发生而高浓度NAA抑制根发生。在NAA浓度为0.0~0.3 mg·L−1时,随着浓度的不断提高,生根系数不断提高,NAA浓度为0.3 mg·L−1时,生根系数最高,达4.63;而当NAA浓度为0.4 mg·L−1,生根系数开始下降。
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组培苗鳞茎移栽至消毒完全的不同基质中,10 d左右出现鳞片叶,同时有新根产生。由表5可知,在草炭与蛭石比例为1∶1的基质中的组培苗移栽苗长势健壮且成活率最高达95.31%。