Isolation, Identification and Pathogenicity of Pathogens of Bletilla Striata Leaf Blight

2023年3月17日于成都市农林科学院大棚采集白及病害样品，装入自封袋中于4℃冰箱内保存，在实验室对引起白及样品发病的病原菌进行分离培养。

采用组织分离法^[11]分离白及病害发病部位的菌株，将样品用无菌蒸馏水冲洗并晾干。使用灭菌后的解剖刀在白及叶片或茎干病健交界处切下4 mm×4 mm的组织块。将组织放入75%乙醇中40 s进行消毒，用灭菌蒸馏水冲洗3次^[12-14]。灭菌镊子将消毒后的组织块放置在无菌滤纸上，晾干后放置于PDA平板上，28℃避光培养2—3 d。进行纯化培养，备用^[15]。

用无菌打孔器（6 mm）在待测菌株菌落边缘取菌饼。选择生长健康的白及植株作为接种材料，用手术刀在白及叶片及茎干处划“十”字，将菌饼接入伤口处，接种无菌PDA培养基作为阴性对照（CK）。每株划伤2片叶子+1次茎干，每个处理接种5株白及，并将每个菌株处理用薄膜单独隔出小拱棚。接种后隔天观察发病情况并及时补水。对于接种后发病的样本，采用组织分离法^[11]再次分离病原菌，并与原分离菌进行比较。

将分离纯化的待测菌株送往擎科生物公司进行菌株一代测序，将测序结果与NCBI中的序列进行比对，使用MEGA11.0软件采用邻接法（Neighbor-joining,NJ）构建系统进化树。

本次试验共采集到3种不同病症的白及样品，如图1所示（见图1 A，B，C）。第一种病害表现病症特征为枝干上出现明显的灰色霉层（见图1 A），第二种病害表现的病症特征为叶片与枝干交界处腐烂变软（见图1 B），第三种病害表现的病症特征为叶片背部有棕色水渍（见图1 C）。

Figure 1.  Samples of 3 Bletilla striata diseases

从3份病害样品中，分离纯化出6株病原菌。将分离的菌株进行形态学鉴定，观察菌落的形态特征，并对菌落进行拍照。在光学显微镜下对病原真菌的显微特征进行观察。

结果如下：图2-A菌落棉絮状、灰黑色，生长速度快，茂盛、向上生长、产孢丰富；图2-a分生孢子卵圆形，无色，单孢，（5.3~8.3）μm×（5.9~9.1）μm。图2-B菌落表面蓬松，气生菌丝正面白色，菌丝密集旺盛，向平板边缘蔓延生长，培养基背面呈红色；图2-b大分生孢子微弯曲，有明显间隔，中心细胞宽，顶端微锥形，大小约为(10.8~16.2)μm× (4.8~7.4)μm。图2-C菌丝呈现出放射状生长的形态，黑曲霉菌落的颜色逐渐加深，变为深灰色至黑色，而且表面会出现裂纹、皱褶等不规则形态；图2-c分生孢子镰刀形，多隔，多胞，顶胞锥形，大小为(14.2~27)μm× (2.8~7)μm。图2-D菌落表面蓬松，气生菌丝正面米白色，菌丝密集旺盛，向平板边缘蔓延生长，培养基背面呈橙色；图2-d大型分生孢子弯镰刀型，大小为(8.9~15.8)μm×(1.7~5.1)μm。图2-E菌落表面蓬松，初期为白色丝状菌落，形成孢子后菌落变成灰褐色；图2-e分生孢子椭圆形，无横隔，孢子梗直立无色，不分枝，大小为(3.1~5.8)μm×(1.9~2.6)μm；图2-F菌丝呈现出放射状生长，菌落的颜色逐渐加深，变为深灰色至黑色，表面出现裂纹等不规则形态,皱褶；图2-f分生孢子球形，表面周生小刺，产孢结构单层，大小为(1.6~1.9 )μm×(1.3~1.6)μm。

Figure 2.  Morphological characteristics of 6 strains of Bletilla striata fungus

本试验分离纯化得到6株白及待测菌株（BJ1.1、BJ1.2、BJ1.4、BJ2.3、BJ3.1、BJ3.4），进行致病性测试。

6株病原菌能引起白及不同程度的软化、腐烂、皱缩（见图3）。在真菌病害中，BJ1.1、BJ1.2、BJ1.4使白及植株的发病速率更快，致病性更强，发病率大于80%（见图3 -A,B,C）。BJ2.3、BJ3.1、BJ3.4的发病速率一般（见图3-D,E,F），但也对白及表现出一定的致病性。将白及上发病的病原菌重新接种至无菌平板上，接种后分离获得菌株与原分离菌株形态一致，根据柯赫氏法则证明BJ1.1、BJ1.2、BJ1.4、BJ2.3、BJ3.1、BJ3.4为白及的致病菌。

Figure 3.  Reverse grafting test of 6 strains and pathogenic bacteria

使用真菌通用引物ITS对分离得到待测菌株进行测序。将测序获得的ITS序列与NCBI核酸数据库中序列进行比对和同源性分析，利用MEGA 11软件构建系统发育树确定菌株种属关系。结果如图4所示，结合形态特征及系统进化树分析结果，确定真菌病原菌中，BJ1.1是灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、BJ1.2是角化镰刀菌(F. keratoplasticum)、BJ1.4为尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、BJ2.3是木贼镰刀菌(F. equiseti)、BJ3.1是易脆毛霉(Mucor fragilis)、BJ3.4是日本曲霉(Aspergillus japonicus)。rDNA-ITS基因序列已存入NCBI数据库，BJ1.1、BJ1.2、BJ1.4、BJ2.3、BJ3.1和BJ3.4的登录号分别为OR418377、OR418378、OR418379、OR418380、OR418381、OR418382。

Figure 4.  Fungal phylogenetic tree based on rDNA-ITS gene sequence

白及属于一种较珍稀的中草药材料，内含多种活性成分^[16]。在临床医治方面也得到进一步的利用，具有较高的商业利用和研究价值，市场需求量高。由于白及的分布较少、药用价值高，白及的大规模种植已成为一种趋势。而单一的种植环境易导致病害大面积的发生，从四川白及病样中分离纯化得到6株病原菌，BJ1.1 (B. cinerea)、BJ1.2 (F. keratoplasticum)、BJ1.4 (F. oxysporum)、BJ2.3 (F. equiseti)、BJ3.1 (M. fragilis)、BJ3.4 (A. japonicus)，对白及植株均表现出致病性。曾令祥等^[17]曾在贵州采用踏查、普查和定点定时的方式对贵州白及中药材病虫害种类进行了调查，结果表明贵州白及常见病害有4种，即块茎腐烂病、块茎生理性腐烂病、白及叶褐斑病和白及叶斑灰霉病，其中白及灰霉病与本实验中BJ1.1(B. cinerea)一致。孙丽丽等^[18]在云南丽江白及栽培基地分离出多种镰刀菌。研究表明，镰刀菌会引发白及根腐病。其中尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、楔形镰刀菌对白及均有致病力，尖孢镰刀菌接种后的致病力达到 100%。宋莉莎^[19]在贵州贵阳调查发现真菌病害5种，明确了叶褐斑病病原菌为燕麦镰刀菌(F. avenaceum)，幼苗叶斑病病原菌为木贼镰刀菌(F. equiseti)，块茎腐烂病病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani)，灰霉病病原菌为灰葡萄孢(B. cinerea)，白及鞘锈菌(Coleosporium bletilla)。赵彩呈等^[20]发现引起白及根腐病的病原真菌是尖孢镰刀菌(F. oxysporum)。而BJ1.2 角化镰刀菌(F. keratoplasticum)、BJ3.1易脆毛霉 (M. fragilis)、BJ3.4日本曲霉 (A. japonicus)，对白及的致病性未见报道。究其原因，可能是标本采集地不同，引起病害的优势菌株不同，表明多种病原菌均可引起白及的腐烂病。这为在生产中防治白及病害提供了理论依据，之后可在此基础上，开展白及的防治等方面的研究。