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干旱作为植物逆境胁迫影响众多环境因子中的最普遍、最主要形式，是影响种子萌发的关键因素[1]。种子萌发对干旱胁迫的响应机理如避旱或适旱萌发，从侧面反映了其适应某一类环境的生态机制。用PEG-6 000溶液渗透方法探讨植物种子对干旱胁迫萌发特性的响应，具有简单易行、周期短、重复性好等特点，近年来被广泛地用于植物种子萌发期的耐旱性研究[2-5]。岩柿（Diospyros dumetorum）是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros) 常绿小乔木，又名乌木果（文山），乌木（丽江、宁蒗、禄劝），乌木树（武定），紫藿香、涩藿香（玉溪）广泛分布于金沙江、元江、怒江流域等干旱少雨、土壤贫瘠的干热河谷区域[6-7]。岩柿受樵采等人为因素影响矮化，因其发达根系具较强的萌生和根孽作用而广泛分布，为区域植被再生重建保存了有限的繁殖体[8-9]。岩柿，叶和果实可入药食用，如新鲜或干燥叶，可用于治"咳嗽吐血、止渴生津"，具有药用价值[10]。关于岩柿育种育苗方面，目前还未见其报道。本试验从种子萌发条件、萌发情况入手，探讨其种子萌发期对抗旱能力及环境温度对种子萌发的影响，为其种苗规模化生产及在干热河谷生态恢复和重建过程中应用的可能性提供理论和科学依据。
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试验用岩柿果实2021年12月采自于云南省大理州永胜县热河乡的野生植株，母树生长健壮、长势良好，种子剥离后用水选法去除空粒和夹杂物，经表面阴干，选取饱满、大小均匀的种子4℃低温保存[11]。测定种子大小、重量及活力 [11]，种子千粒重测定采用百粒法（167.49±0.34 g）；用游标卡尺测量120粒种子的长轴和短轴，平均值分别为10.36±0.10 mm、6.06±0.05 mm；种子烘干后测得平均含水量为18.18±0.29 %；TTC法种子活力测定其平均活力为83.33±3.30 %。
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2022年1-3月在中国林业科学研究院高原林业研究所国家林草局重点实验室进行萌发实验，首先进行消毒处理，用3 %的高锰酸钾溶液浸泡岩柿种子30 min消毒，然后再用流水冲洗2小时[11]。参考陈钏等人[12-15]配置不同浓度(0%、5%、10%、15%、20%、25%)PEG-6000溶液，对照CK为蒸馏水（0%），分别对应不同的水势（0 MPa、−0.58 MPa、−1.66 MPa、−3.256 MPa、−5.346 MPa、−7.490 MPa）[16-17]，以此来模拟干旱胁迫，6个处理每个处理3个重复，每重复30粒种子。试验时将种子均匀铺放在垫设 2 层滤纸的培养皿内，温度设置为0℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃[18~22]，光照条件为12 h光/12 h暗，光强为3000 lx[12-15]，在光照恒温箱中进行培养。每天称量培养皿的质量，并用蒸馏水补足其损失水量以保证PEG的渗透势不变[13-16.25]。观察并记录种子萌发情况，将每处理中有1粒种子萌发作为该处理发芽的开始，统计种子的发芽数，连续7 d不再有种子发芽作为发芽的结束。
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活力指数 VI = GI × S[27];
抗旱指数 PI= ( PIS ) / ( PIC )[29]。
式中:x表供试种子发芽的数量，X表示供试种子的数量；Y为发芽达最高峰时的发芽数量，Gt 表示在第 t d的发芽数；Dt 表示与 Gt 相对应种子出芽经历时间；S 表示规定时间( 60 d) 内单株幼苗的平均根长。PIS表示干旱胁迫下种子萌发指数，PIC表示对照种子萌发指数，式中PIS =1.00 nd2 + 0.75 nd4 + 0.5 nd6 + 0.25 nd8 ( nd2、nd4、nd6、nd8分别是每个处理萌发开始后2、4、6、8 d的种子萌发率)
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采用Excel 2016、SPSS22.0 等系统软件进行数据统计和分析绘图，对数据进行单因素方差分析，多重比较采用 Duncan 法。
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由表1可知，10℃和25% PEG条件下所有处理都不萌发，随着PEG浓度的增加，四种温度处理下的发芽率都呈明显的先升高后下降明显。温度过高和过低对发芽率均存在不同程度影响。15℃、20℃、25℃、30℃各干旱处理间发芽率平均值分别为20.74%、55.56%、82.89%、68.45%。其中，30℃和25℃的轻度干旱处理PEG浓度为5%时发芽率最大，88.89、94.44% ，其平均值为91.66%。15℃时0%、10% PEG胁迫处理下发芽率值相对较小，分别为22.22%、12.22%，其平均值为17.22%。PEG胁迫强度最大时，15℃、20℃、25℃、30℃相比处理前发芽率分别降低了10.00%、42.48%、25.56%、47.77%。15℃在0%、5% PEG浓度时，处理间差异不著，超过5%PEG处理发芽率显著下降。20℃在0%~10%PEG处理时差异显著，而在10% PEG浓度时，发芽率就已经显著下降。25℃在0 %、10%PEG处理时发芽率差异显著，而5%PEG与其他处理存在显著差异，发芽率最大，超过10%PEG处理发芽率显著下降。30℃在0 %~5%PEG处理时发芽率差异不显著，超过5%发芽率显著下降。发芽率对温度和PEG干旱胁迫的变化响应较为明显。
温度/(℃)
Temperature ℃PEG(%) GE GR GI VI PI 30 0 83.33±1.92aAB 41.11±4.00bB 11.41±0.87aA 14.06±2.37bB 1.00±0.17abAB 5 88.89±1.11aA 57.78±1.11aA 15.01±0.93aA 22.78±4.48aA 1.11±0.07abAB 10 75.56±1.11bB 47.78±1.11bB 11.02±0.75bB 14.96±1.83bB 0.77±0.18cC 15 58.89±2.94cC 25.56±1.11cC 5.57±0.61cC 4.94±0.49cC 0.72±0.25abAB 20 35.56±2.94dD 16.66±1.92dC 2.22±0.30dD 1.58±0.38dD 0.61±0.14aA 25 — — — — 25 0 87.78 ±2.94abAB 53.33±3.33aAB 17.4±0.87aA 23.81±4.91bB 1.01±0.06aA 5 94.44±1.11aA 58.89±2.94aA 19.45±0.93aA 28.21±10.21aA 0.99±0.29aA 10 86.67±1.93bAB 38.89±6.76bBC 13.43±0.75bB 24.71±7.92bB 0.64±0.42aA 15 83.33±1.92bB 30.00±3.8bCD 9.69±0.61cC 13.72±1.73cC 0.55±0.31aA 20 62.22±2.94cC 15.56±1.11cD 4.09±0.30dD 4.90±1.12dD 0.54±0.43aA 25 — — — — — 20 0 85.57±2.94aA 48.89±2.93bA 17.02±0.81bB 20.65±1.97bB 1.00±0.13bB 5 91.11±1.11aA 61.11±2.22aA 18.78±0.90aB 26.47±7.41aA 1.42±0.20aA 10 83.33±1.92aA 47.78±2.94bA 13.92±0.74bB 21.42±3.85bB 1.20±0.17cC 15 67.78±4.00bB 27.78±6.19cB 5.49±0.40cC 8.00±1.19cC 0.43±0.03dD 20 37.78±4.00cC 14.44±1.11dB 3.49±0.26dD 2.83±0.22dD 0.41±0.14dD 25 — — — — — 15 0 22.22±1.11aAB 13.53±0.98bB 0.28±0.04bB 0.32±0.06bB 1.00±0.09aA 5 27.78±2.94aA 17.04±1.21aA 0.48±0.05aA 0.65±0.06aA 1.17±0.45aA 10 12.22±1.11bB 8.00±0.53cC 0.13±0.02bB 0.21±0.08bB 0.84±0.04aA 15 — — — — — 20 — — — — — 25 — — — — — 10 0 — — — — 5 — — — — 10 — — — — 15 — — — — — 20 — — — — — 25 — — — — — 注：小写字母a、b、c等表示P<0.05水平上差异显著，大写字母A、B、C等表示P<0.01水平上差异极显著。GE(%)为发芽率，GR（%）为发芽势，GI为发芽指数，VI活力指数， PI为抗旱指数，下同。
Note: The lowercase letters a, b, c indicate significant differences at the level of P<0.05, while the uppercase letters A, B, C indicate significant differences at the level of P<0.01. GE(%) is the germination rate, GR(%) is the germination potential, GI is the germination index, VI vitality index and PI is the drought resistance index, the same below.Table 1. Effects of PEG drought stress and different temperature treatments on seed germination characteristics of Diospyros dumetorum
由表1 可以看出，随着PEG浓度的逐渐增大，四种温度下的发芽势、发芽指数、明显的先升高后下降，PEG浓度为0%~10%时，四种温度发芽势下降趋势皆较平缓，但当PEG浓度增至15%时发芽势明显下降，尤其是15% PEG与20% PEG发芽势迅速下降。说明PEG浓度>10%时，对种子萌发造成的影响显著增强。种子的发芽势随着PEG浓度的增加，下降较为明显，且当PEG浓度为10%时，种子的发芽势显著高于15% PEG和20% PEG。15℃下的整体发芽势要低于20℃、25℃和30℃。排序:15% < 25%< 20%< 30%。说明在PEG浓度干旱胁迫强度较大时，对四种温度下的发芽势影响都有着较大的影响。
当温度处理为15℃ 时PEG干旱胁迫对种子发芽指数和活力指数影响总体较小，对20℃、25℃和30℃种子萌发影响较大。15℃、20℃、25℃和30℃种子发芽指数在5%~20% PEG浓度区间内，发芽指数下降幅度较大。说明10%~20% PEG浓度区间内，PEG干旱胁迫对种子的萌发具有明显抑制作用。从PEG和温度处理对岩柿种子的影响中可以看出，随着PEG浓度的升高，四种温度下的发芽指数均呈明显的先升高后下降趋势，种子在15℃、20℃、25℃、30℃时5% PEG的处理下发芽指数、活力指数达到最大值，除在15℃超过10% PEG的处理下达到最小值为外，其余三种温度在25% PEG浓度处理下发芽指数、活力指数达到最小值。在PEG浓度为5%、10%、20%时，种间差异显著，并发现在0%~20% PEG浓度时，温度在25 ℃时组间内的各发芽指数活力指数皆高温度在20℃和30 ℃的发芽指数，发芽指数、活力指数在15 ℃时最低，在0%~5% PEG浓度时，活力指数呈现增加的趋势，增加趋势较为平缓，当PEG浓度增大至10%及20%时，其活力指数显著下降。0%~5% PEG浓度区间内，温度在15℃时在0%~10% PEG浓度区间内其活力指数变化幅度较小，温度20℃、25℃、30℃时在10%~20%PEG浓度区间内，随着PEG浓度的增加，发芽指数和活力指数总体都呈下降趋势。
从表1 PEG中可以得出，在15% PEG胁迫时,温度为15℃、20℃、25℃和30℃的抗旱指数均高于对照，温度为25℃时的抗旱指数与对照相差较小，其余三种温度下种子的抗旱指数表现显著降低。抗旱指数达到最大值时为1℃、20℃、25℃和30℃时5% PEG干旱胁迫处理组，其中15℃最小值10% PEG处理组，抗旱指数变化幅度较小。其他温度下达到最小值为20% PEG的处理组。30℃抗旱指数整体上要高于15℃、20℃和25℃。岩柿的抗旱指数随着PEG浓度逐渐增大，在5%~20% PEG浓度区间内种间变化显著，总体都呈下降趋势。但在PEG浓度为15%时，0%、5%、10%、20% PEG浓度时的活力指数，在0%~5% PEG浓度区间内，活力指数变化幅度较小，在PEG浓度增大至10%及20%时，其抗旱指数显著下降。温度在20℃、25℃、30℃时0%~25% PEG浓度区间内，变化较大。随着PEG浓度的提高，各温度处理的抗旱指数均表现显著下降趋势。在25% PEG浓度胁迫下，平均抗早指数达到最低值，这表明萌发期抗旱指数对PEG模拟的干旱胁迫较为敏感。
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对不同温度下，对照组(CK)蒸馏水处理组发芽率均值进行线性回归分析，得出的拟合曲线图1，二次曲线模型达到显著水平P<0.05，决定系数R2=0.9371，其模型曲线可靠度最大且适宜，二次曲线模型y = −0.6778x2 + 34.211x—335.72为描述温度与岩柿种子发芽率关系的最优模型。b1的系数34.211>1，说明随着温度的增加，种子发芽率也逐渐增加，温度的升高对发芽率起促进作用，但随着温度的增加，b2的系数为 −0.6778< 0，说明当温度超过一定值时，发芽率就会出现下降的趋势，求解得到这个转折点为34.211/(2* 0.6778)=25.24，此时的值为最适宜的温度。从图1拟合的模型曲线中，接近峰值适宜萌发的温度处理为20℃~30℃范围内，可以看出四种温度处理下，25℃更接近峰值，种子萌发率最高。
Figure 1. Curve fitting of temperature and germination rate
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通过，温度对岩柿种子萌发影响，得出四种温度下，岩柿种子萌发率最高温度是25 ℃。对此温度下不同PEG干旱胁迫处理的种子发芽率进行回归分析拟合的曲线得如图2所示。二次曲线模型达到显著水平P<0.05，模型决定系数R2=0.943，可靠度值最大，二次曲线模型y = −0.2841x2 + 4.0238x + 83.889为描述PEG处理浓度与岩柿种子发芽率关系的最优模型。b1的系数4.0238>1，说明随着PEG浓度的增加，种子发芽率也逐渐增加，PEG浓度的升高对发芽率有着引发作用，但随着PEG浓度的增加，b2的系数为 −0.2841 < 0，说明当PEG波动超过一定值时，发芽率就会出现下降的趋势，求解得到这个转折点为4.0238/(2*0.2841）=7.08，超过此PEG浓度处理发芽率就会受到不同程度的抑制。从图1拟合的模型曲线中得出，5% PEG处理更接近发芽率峰值，0%~25% PEG处理下岩柿种子能萌发。与对照相比，随着PEG干旱胁迫的增加发芽率逐渐下降，10%~20% PEG处理萌发率下降更为明显。
Figure 2. Fitting curve of PEG drought stress and germination rate
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PEG干旱胁迫与萌发指标相关系数性差异较大（见表2），发芽势、发芽指数、活力指数均与PEG浓度呈极显著负相关，说明随着干旱胁迫的加深，发芽势、发芽指数、活力指数明显降低。试验结果显示，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、都与PEG浓度呈负相关，既当PEG浓度增加时上述指标值都减小。PEG浓度与发芽率呈显著负相关(P<0.05)，与发芽指数、活力指数均呈极显著负相关(P<0.01)，与抗旱指数与PEG浓度呈负相关，相关性不显著（P>0.05)。发芽率与发芽势、发芽指数、活力指数有极显著正相关(P<0.01)，与抗旱指数呈显著负相关(P<0.05)。发芽势与发芽指数、活力指数和抗旱指数均呈极显著正相关(P<0.01)。发芽指数与活力指数呈极显著正相关(P<0.01)，与抗旱指数相关性不显著（P>0.05)。活力指数与抗旱指数相关性不显著（P>0.05)。
PEG GE GR GI VI PI PEG 1 GE −0.32* 1 GR −0.19 0.88** 1 GI −0.43** 0.96** 0.82** 1 VI −0.39** 0.82** 0.73** 0.87** 1 PI −0.03 0.77* 0.36** 0.22 0.19 1 注：* 表示在P< 0.05 水平上显著相关，** 表示在P<0 .01 水平上极显著相关。
Note: * indicates significant correlation at the level of P< 0.05, * * indicates extremely significant correlation at the level of P<0 .01.Table 2. Correlation analysis of PEG drought stress seed germination indexes
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种子作为植物最重要的繁殖器官，其萌发阶段的耐旱状况可以在一定程度上反映其抗旱能力。一般情况下，耐旱植物的萌发在一定范围的干旱程度内是不受影响的，当外界干旱程度超过其耐受范围时其萌发及生长状况会受到显著的影响[29]。岩柿种子在PEG胁迫下其发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数和抗旱指数等指标都有明显的变化。不同的温度处理下减小的幅度不同，不同指标的变化也不相同,随着PEG浓度的增加，这些指标都显著或明显减小,此实验结果与（李慧等，2022；程继铭等，2020，杨娇娇等，2020）研究结果一致。
从总体上看，随着PEG浓度的增加，各个温度处理下岩柿种子的相对发芽率、发芽势、发芽指数和相对活力指数均呈显著下降趋势，此实验结果与前人研究结果相似[25-29]。种子的相对发芽势、发芽率、发芽指数在PEG低浓度时都有轻微上升趋势，可能因低浓度的PEG处理对种子萌发起引发作用所致(汪桂凤，2019；王小梅，2015；江远芳，2014）。随着PEG浓度的增大，四种温度处理下岩柿种子发芽率、发芽指数、活力指数、发芽势皆呈下降趋势。PEG浓度为20%时，对比15%PEG浓度处理，四种温度处理下的发芽率都显著下降，20℃、25℃、30℃分别降低了12.97%、22.78%、13.85%，说明当PEG浓度处于15%~20%区间时，PEG干旱胁迫对四种温度处理下种子的发芽率抑制作用显著。实验中对照组与轻度干旱的5%、10%PEG浓度对岩柿种子发芽率、发芽势影响结果与张航等（2021）对榆树种子的研究结果及孔佳茜等（2020）对大麻种子的研究结果一致。
结合岩柿分布区干热河谷，气候条件，年均温>20℃, 日均温>10℃且年积温>7 000 ℃的水平(钟祥浩, 2000; 金振洲和欧晓昆, 2000)，结合本试验结果15℃~30℃岩柿种子可以萌发，分布区温度情况满足岩柿种子萌发所需要求，这与它集中分布于干热河谷地区相符。通过张荣祖等(1992)明确提出的干热河谷气候指标，最冷月平均气温>12℃, 最暖月平均气温24℃—28℃, 日均温≥10 ℃, 年平均积温>7000℃，年平均降雨量600—800 mm, 年平均蒸发量达2750—3850 mm，结合本试验结果低温10℃岩柿种子不萌发，20℃~30℃岩柿种子萌发率较高，其最冷月岩柿种子存在不能正常萌发的现象，其最暖月的温度适宜岩柿种子的萌发。干热河谷区内主要干流是长江上游的金沙江流域，年径流量约为5.4×1010 m3，年降雨量约为680.7 mm，可分为干（旱）湿两季：干（旱）季为每年 11 月至翌年 4 月，降雨约占全年总降雨量的 18%以下；湿（雨）季为每年 5—10月， 降雨约占全年总降雨量的 82—92%，干旱指数大于2.5，水热矛盾突出（钟祥浩, 000; 李昆等, 2011）。结合本试验结果，超过15% PEG干旱胁迫处理对应的水势（−3.256 MPa）时岩柿种子发芽率、发芽势，发芽指数、活力指数、抗旱指数受到抑制。0%、5%、10% PEG处理分别对应的低水势（0 MPa、−0.58 MPa、−1.66 MPa）种子发芽率高。干（旱）季的高水势不宜岩柿种子萌发，湿（雨）季低水势则适宜岩柿种子的萌发。在相应的季节，进行播种育苗能最大限度提高种子的发芽率。
PEG干旱胁迫处理对岩柿种子萌发期，发芽率、发芽势、发芽指数、抗旱指数均有着不同程度的影响。通过PEG干旱胁迫种子萌发指标相关性分析，得出PEG浓度对不同温度下的萌发指标均有着不同程度的显著差异。通过温度与岩柿种子发芽率回归方程拟合曲线分析，发现20℃~30℃作为岩柿种子萌发期抗旱性差异的理想温度。通过不同温度和PEG浓度处理岩柿种子萌发特性的比较分析，随着干旱胁迫程度的增加，15%~25%PEG浓度处理与对照组（CK）、5%、10%PEG处理相比对其萌发指标表现得明显，差异性较为显著。从PEG干旱胁迫对岩柿种子萌发率的影响回归方程拟合曲线中发现，0%~25%PEG浓度可作为岩柿种子萌发期抗旱性差异的理想浓度，区分岩柿种子萌发期抗旱性差异的浓度建议选择为10%~20%PEG干旱胁迫处理。
Effects of PEG-6000 Simulated Drought Stress and Temperature on Seed Germination of Diospyros dumetorum
doi: 10.12172/202212080001
- Received Date: 2022-12-08
- Available Online: 2023-04-18
- Publish Date: 2023-10-25
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Key words:
- Diospyros dumetorum /
- PEG stress /
- Seed germination
Abstract: In order to understand the effects of drought stress and different temperature treatments on seed germination of Diospyros dumetorum, to clarify the appropriate temperature for seed germination and PEG drought tolerance degree, and to explore the drought resistance ability of Diospyros dumetorum seeds during germination. The simulated drought stress experiments of PEG-6000 solution (0%, 5%,10%,15%, 20%, 25%) was carried out with Diospyros dumetorum seeds as materials at 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃ and other temperatures. The results showed that: (1) The seeds could not germinate at low temperature (0℃, 10℃) and under severe drought stress (25% PEG). (2) The seeds could germinate at temperatures of 15℃, 20℃, 25℃, 30℃ under PEG mild drought (5% PEG), moderate drought (10% PEG, 15% PEG) and severe drought (20% PEG), and the seed germination index was inhibited to some extent when the concentration exceeds 10% PEG. (3) With the increase of PEG concentration, the stress degree of seeds was higher, and all germination indexes of seeds showed a trend of increasing first and then decreasing. Conclusion: the seed germination of Diospyros dumetorumn was greatly affected by temperature and drought stress. The suitable temperature for seed germination is 20℃~30℃, and the PEG drought tolerance range was 0~25% PEG drought condition. The germination rate was negatively correlated with PEG concentration (P<0.05), and the germination index and vigor index were negatively correlated with PEG concentration (P<0.01). Drought resistance index was negatively correlated with PEG concentration, but the correlation was not significant (P>0.05).
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