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油樟(Cinnamomum longepaniculatum)叶性状可能是影响1,8-桉叶油素产出的重要因素，而叶性状变化又与微量元素是密切相关的。微量元素（铁、锰、锌、硒等）在植物内含量很少，但各元素在维持植物正常的新陈代谢方面具有重要意义[1-2]。在农林业生产中施加微量元素已被广泛运用，如孙志刚等[3]对秃杉苗木施微量元素的研究中发现，喷施0.05% 的硫酸锌和0.05% 的硫酸锰，秃杉苗木生长最好，1年生苗高达13.8 cm，2年生苗高达 30.6 cm。高雪冬等[4]研究发现，中微肥施用能够提高大豆不同生育期的株高、干物质积累量和叶绿素含量,对大豆生产起到积极的促进作用。但是截至目前尚无油樟如何施加微量元素的研究报道。因此对一年生盆栽种植油樟进行不同微量元素、土壤酸碱性试验，旨在探索一种提高油樟叶1,8-桉叶油素含量的方法，以期为油樟定向施肥提供理论基础。
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供试油樟一年生种子苗采自四川省宜宾市观音镇。试验在四川云辰园林科技有限公司的智能温室内进行。采用盆栽实验方法，选取生长均匀、高度一致的种子苗种植于栽培盆中，每盆1株。土壤类型红砂壤，每盆装土约5 kg。盆栽土中有效铁：9.42 mg·kg−1，有效锰：3.22 mg·kg−1，有效锌：0.41 mg·kg−1，硒：0.22 mg·kg−1，pH值为7.4。
试剂：正己烷、无水硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、亚硒酸钠、硫酸、氢氧化钠、1,8-桉叶油素(均为分析纯，购自成都市科隆化工试剂厂)。
仪器：气相色谱仪(7820A型，美国安捷伦公司)，苏泊尔多功能榨汁机(JS39D-250，浙江苏泊尔股份有限公司)，高速冷冻离心机(KDC-140HR，安徽中科中佳科学仪器有限公司)，超声波细胞粉碎机( LC-JY92-IIN，上海力辰仪器科技有限公司)。
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试验采用硫酸亚铁(A)、硫酸锰(B)、硫酸锌(C)、亚硒酸钠(D)和pH值(E)五个因素，每个因素均设定为四个水平，按正交表 L16(45)进行试验，完全随机排列，共16个处理，每个处理3次重复，每次重复6株，以1号处理作为对照。试验因素设计见表1。首次喷施时间为2022年1月5日，后续喷施时间为2022年5月份至7月份每个月的5日。根据栽培盆中土壤水分状况，每隔3—5 d等量浇1.2 L清水，以保证植株正常生长。
表 1 实验因素设计表
Table 1. Design of experimental factors
水平 硫酸亚铁A / % 硫酸锰B / % 硫酸锌C / % 亚硒酸钠
D /(mg·L-1)pH值 E 1 0 0 0 0 7.5 2 0.1 0.1 0.1 2 4 3 0.3 0.3 0.3 6 5.5 4 0.5 0.5 0.5 10 7 -
试验于8月5日结束处理，并于8月初采集每一样株中下部各方向的较成熟叶片，当天将各个试验组叶片分开、擦净，称量其鲜重，并将数据整理保存。油樟叶片精油采用超声波法萃取[5]，1,8-桉叶油素含量采用气相色谱法检测，具体分析条件参照文献[6]。
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采用Excel 2017和SPSS 22.0统计分析软件对试验数据进行方差分析和回归建模。
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直接比较明确实际优处理：直接比较16个处理的结果显示第2个处理的1,8-桉叶油素含量最高，即直接比较的实际优处理是A1B2C2D2E2，其次是第12个处理，A3B4C2D1E3。它们是经过试验的实际处理，结果较为可靠，可进一步在小范围内试验及应用。
优水平组合提出预测优处理：计算正交实验的数量结果，观察变化的趋势，找出更好的处理组合。求出各因素相同水平的试验反应变量指标和，将各因素最好的水平组合在一起，从而提出预测的优处理，以供进一步试验验证及下一步研究。由表2可以看出，第一列因素A的四个1,8-桉叶油素含量之和为41.42，而因素A第一个水平的平均值为10.36，将五个因素影响最高的水平组合到一起，得预测的优处理A1B4C2D3E3，即最佳的处理路线：即喷施0.5%硫酸锰，0.1%硫酸锌，0.3%亚硒酸钠，pH值为5.5，不施硫酸亚铁时的油樟叶中1,8-桉叶油素含量最高。
表 2 正交分析表
Table 2. Orthogonal analysis result
序号 A B C D E 1,8-桉叶油素/(mg·g-1) 1 0 0 0 0 7.5 7.3 2 0 0.1 0.1 2 4 13.76 3 0 0.3 0.3 6 5.5 10.01 4 0 0.5 0.5 10 7 10.35 5 0.1 0 0.1 6 7 11.07 6 0.1 0.1 0 10 5.5 9.07 7 0.1 0.3 0.5 0 4 8.38 8 0.1 0.5 0.3 2 7.5 9.89 9 0.3 0 0.3 10 4 5.75 10 0.3 0.1 0.5 6 7.5 10.64 11 0.3 0.3 0 2 7 7.97 12 0.3 0.5 0.1 0 5.5 12.87 13 0.5 0 0.5 2 5.5 9.15 14 0.5 0.1 0.3 0 7 9.13 15 0.5 0.3 0.1 10 7.5 11.20 16 0.5 0.5 0 6 4 10.24 Y1 41.42 33.27 34.58 37.68 39.03 Y2 38.41 42.60 48.90 40.77 38.13 Y3 37.23 37.56 34.78 41.96 41.10 Y4 39.72 43.35 38.52 36.37 38.52 y1 10.36 8.32 8.65 9.42 9.76 y2 9.60 10.65 12.23 10.19 9.53 y3 9.31 9.39 8.70 10.49 10.28 y4 9.93 10.84 9.63 9.09 9.63 R 4.19 10.08 14.32 5.59 2.97 注：Yi表示任一列上水平号为i（i=1,2,3,4）时，所对应的试验结果之和。
yi=Yi/n(n为对应因素所含有的水平个数)
R=Yi max-Yi min按照极差R值大小排列出因素主次序如下表3。极差大说明此因素的不同水平产生的差异较大，是重要的因素。
表 3 极差分析表
Table 3. Range analysis table
主次 硫酸锌 硫酸锰 亚硒酸钠 硫酸亚铁 pH C2 B4 D3 A1 E3 可以看出，五种因素的主次关系为：C>B>D>A>E。
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用Excel分析数据得到如下的主效应图1。根据主效应图中各因素端点值差值得出影响的因素重要性依次是C>B>D>A>E。E的线段很缓，说明此因素影响不显著，在做方差分析时，可以剔除该因素。
图 1 主效应图
Figure 1. Main effect diagram
表4为正交实验方差分析表，用来分析各因素对1,8-桉叶油素含量影响的差异。由表4可知，对油樟叶精油中1,8-桉叶油素含量的影响，硫酸锰(因素B)和硫酸锌(因素C)在P<0. 05水平上对1,8-桉叶油素含量的影响均显著。硫酸亚铁(因素A)和亚硒酸钠(因素D)对1,8-桉叶油素含量的影响均不显著。
表 4 方差分析表
Table 4. Results of variance analysis
变异来源 DF SS MS F-Value P-value A 3 2.426 0.809 1.850 0.313 B 3 16.659 5.553 12.702 0.033 C 3 33.858 11.286 25.816 0.012 D 3 5.100 1.700 3.889 0.147 Model 12 58.044 4.837 11.064 0.036 Error 3 1.312 0.437 Corrected Total 15 59.335 -
利用硫酸锰和硫酸锌的施用量与1,8-桉叶油素含量进行回归方程拟合，建立数学模型。所得回归方程为Y=9.578+ 0.670*X1−0.208*X2。式中，Y代表1,8-桉叶油素含量( mg·g−1 ) ； X1代表硫酸锰施用量(%) ； X2代表硫酸锌施用量(%) ；根据回归方程求得1,8-桉叶油素含量的最高为9.581mg·g−1 ，与之相对应的每盆施用量为0.5%硫酸锰，不施加硫酸亚铁。
由表2数据可看出: 处理4、8、12、16的施肥施用量比较接近根据上述数学模型求得的最优施用量，且处理4、8、12、16的1,8-桉叶油素含量均处于 16个处理组的上游水平。而处理 1、9 以及 13 的1,8-桉叶油素含量均较低，分别为7.30 mg·g−1、5.75 mg·g−1和9.15 mg·g−1，这 3 个处理组都缺施了硫酸锰，说明缺失锰元素将对1,8-桉叶油素的合成产生不良影响。
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综合考虑各处理后油樟叶精油中1,8-桉叶油素含量情况，处理2号1,8-桉叶油素含量最高，故对油樟最优的处理是2号。对正交试验的结果分析其最优水平处理为A1B4C2D3E3，即喷施0.5%硫酸锰，0.1%硫酸锌，0.3%亚硒酸钠，pH值为5.5，不施硫酸亚铁时油樟叶精油中1,8-桉叶油素含量最高。得出的最优处理A1B4C2D3E3，未出现在试验设计的各个组合中，与处理 12（A3B4C2D1E3）最为接近，同时处理12也比较接近数学模型求得的最优施用量且处理12条件下的1,8-桉叶油素含量在各处理中排第2。处理 12（A3B4C2D1E3）并未出现的原因可能是由于：(1)最优的水平处理仅考虑了铁锰锌硒和pH 五种因素的主效应，未考虑各因素之间的交互效应；(2)正交试验设计选用的是全面试验所有组合中部分具有代表性的组合，对其进行分析以反映全面试验的情况。
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正交试验对于探索配方施肥具有明显的优势。采用 L16(45)正交设计方法，开展了盆栽油樟铁锰锌硒和pH施肥配方研究。五种因素对油樟叶精油中1,8-桉叶油素含量影响的主次顺序不同，表现为硫酸锌>硫酸锰>亚硒酸钠>硫酸亚铁>pH。硫酸锰和硫酸锌对1,8-桉叶油素含量的影响均显著，硫酸亚铁和亚硒酸钠对1,8-桉叶油素含量的影响均不显著。对油樟最优处理为A1B4C2D3E3，即喷施0.5%硫酸锰，0.1%硫酸锌，0.3%亚硒酸钠，pH值为5.5，不施硫酸亚铁时油樟叶精油中1,8-桉叶油素含量最高。
有研究表明喷施硫酸锌和硫酸锰有利于秃杉苗木的生长，锌是合成生长素前体－色氨酸的必需元素，锰为形成叶绿素和维持叶绿素正常结构的必需元素[3]。锌、锰等微量元素对芳樟叶精油含量具有促生作用[7]。本试验结果显示硫酸锰和硫酸锌对1,8-桉叶油素含量的影响均显著，说明施锌促进了油樟体内生长素的合成，施锰促进了叶绿素的形成，进而影响油樟叶精油中1,8-桉叶油素含量，具体的作用机理有待进一步研究。
本试验结果是在理想试验条件的基础上得出的，由于在智能温室盆栽试验条件下的光照、水分、施肥量等环境因素和时间因素均由人为控制，试验条件比较稳定，所获得的试验结果仅仅是理论值。而在野外进行油樟的实际培育时，其环境因素变化大且极其复杂，因此在实际生产中若要获得最高的1,8-桉叶油素含量，其施肥配比应根据土壤情况以及林地坡位等环境因素进行综合考虑，并结合获得的最优施肥配比对油樟林地进行科学合理的施肥。
Effects of Different Trace Elements and Soil pH on the Content of 1,8-cineole in Cinnamomum longepaniculatum Leaves
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摘要: 微量元素在植物生长中具有重要作用，开展油樟(Cinnamomum longepaniculatum)施微量元素的研究，对油樟的定向培育具有重要意义。试验结果表明，各微量元素和土壤酸碱性对油樟叶中1,8-桉叶油素含量影响的主次顺序不同；硫酸锰、硫酸锌对油樟叶中1,8-桉叶油素含量的影响显著，硫酸亚铁、亚硒酸钠和pH值对油樟叶中1,8-桉叶油素含量的影响均不显著。综合考虑各处理对油樟叶中1,8-桉叶油素的影响情况，最佳的处理是A1B4C2D3E3，即喷施0.5%硫酸锰，0.1%硫酸锌，0.3%亚硒酸钠，pH值为5.5，不施硫酸亚铁时的油樟叶中1,8-桉叶油素含量最高。Abstract: Trace elements play an important role in plant growth, and it is of great significance to study the application of trace elements to Cinnamomum longepaniculatum for the directional cultivation of C. longepaniculatum. The results showed that different trace elements and soil pH had different effects on the content of 1,8-cineole in C. longepaniculatum leaves. Manganese sulfate and zinc sulfate had significant effects on the content of 1,8-cineole in C. longepaniculatum leaves, while ferrous sulfate, sodium selenite and pH had no significant effects on the content of 1,8-cineole in C. longepaniculatum leaves. Considering the effects of all treatments on 1,8-cineole in C. longepaniculatum leaves, the best treatment was A1B4C2D3E3, namely 0.5% manganese sulfate, 0.1% zinc sulfate, 0.3% sodium selenite, pH value was 5.5, and the content of 1,8-cineole in C. longepaniculatum leaves was the highest without ferrous sulfate.
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Key words:
- Cinnamomum longepaniculatum leaves;
- Trace elements;
- Soil pH;
- 1,8-cineole
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表 1 实验因素设计表
Tab. 1 Design of experimental factors
水平 硫酸亚铁A / % 硫酸锰B / % 硫酸锌C / % 亚硒酸钠
D /(mg·L-1)pH值 E 1 0 0 0 0 7.5 2 0.1 0.1 0.1 2 4 3 0.3 0.3 0.3 6 5.5 4 0.5 0.5 0.5 10 7 
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表 2 正交分析表
Tab. 2 Orthogonal analysis result
序号 A B C D E 1,8-桉叶油素/(mg·g-1) 1 0 0 0 0 7.5 7.3 2 0 0.1 0.1 2 4 13.76 3 0 0.3 0.3 6 5.5 10.01 4 0 0.5 0.5 10 7 10.35 5 0.1 0 0.1 6 7 11.07 6 0.1 0.1 0 10 5.5 9.07 7 0.1 0.3 0.5 0 4 8.38 8 0.1 0.5 0.3 2 7.5 9.89 9 0.3 0 0.3 10 4 5.75 10 0.3 0.1 0.5 6 7.5 10.64 11 0.3 0.3 0 2 7 7.97 12 0.3 0.5 0.1 0 5.5 12.87 13 0.5 0 0.5 2 5.5 9.15 14 0.5 0.1 0.3 0 7 9.13 15 0.5 0.3 0.1 10 7.5 11.20 16 0.5 0.5 0 6 4 10.24 Y1 41.42 33.27 34.58 37.68 39.03 Y2 38.41 42.60 48.90 40.77 38.13 Y3 37.23 37.56 34.78 41.96 41.10 Y4 39.72 43.35 38.52 36.37 38.52 y1 10.36 8.32 8.65 9.42 9.76 y2 9.60 10.65 12.23 10.19 9.53 y3 9.31 9.39 8.70 10.49 10.28 y4 9.93 10.84 9.63 9.09 9.63 R 4.19 10.08 14.32 5.59 2.97 注：Yi表示任一列上水平号为i（i=1,2,3,4）时，所对应的试验结果之和。
yi=Yi/n(n为对应因素所含有的水平个数)
R=Yi max-Yi min
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表 4 方差分析表
Tab. 4 Results of variance analysis
变异来源 DF SS MS F-Value P-value A 3 2.426 0.809 1.850 0.313 B 3 16.659 5.553 12.702 0.033 C 3 33.858 11.286 25.816 0.012 D 3 5.100 1.700 3.889 0.147 Model 12 58.044 4.837 11.064 0.036 Error 3 1.312 0.437 Corrected Total 15 59.335
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[1] Srivastava Bhawana, Singh Priyanka, Shukla Ravindra, et al. A novel combination of the essential oils of cinnamomum camphora and alpinia galanga in checking aflatoxin b production by a toxigenic strain of aspergillus flavus[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(5): 693−697. doi: 10.1007/s11274-007-9526-0 [2] HU Jiangning, ZHANG Bing, ZHU Xuemei , et al. Characterization of medium-chain triacylglycerol (mct)-enriched seed oil from cinnamomum camphora (lauraceae) and its oxidative stability[J]. J. Agric. Food Chem, 2011, 59(9): 4771−4778. [3] 孙志刚,刘云彩,陈强,等. 腾冲秃杉苗木喷施微量元素的效应[J]. 西部林业科学,2016, 45(01):137−141. doi: 10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.01.023 [4] 高雪冬,朱宝国,孟庆英,等. 增施中微量元素肥料对大豆生长发育及产量的影响[J]. 农学学报,2014, 4(07):34−36. doi: 10.3969/j.issn.1007-7774.2014.07.009 [5] 林春松,徐夙侠,章宁,等. 超声波萃取番橄榄挥发油化学成分的GC-MS分析[J]. 热带作物学报,2010, 31(10):1840−1845. doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2010.10.032 [6] 刘盼,刘艳,陈斯玮,等. 气相色谱法测定油樟油中桉油精的含量[J]. 西南医科大学学报,2017, 40(01):64−66. doi: 10.3969/j.issn.1000-2669.2017.01.017 [7] 黄秋良,袁宗胜,谢亚兵,等. 不同微量元素和有机肥对芳樟油料林精油的影响[J]. 安徽农学通报,2020, 26(Z1):57−58. doi: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2020.z1.023 -
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图(1) / 表(4)
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