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核桃（Juglans regia L.）是我国木本油料发展战略中重要木本油料来源。目前，核桃育种工作中，实生选种和杂交育种是最为常见和有效的选育方法。实生选种通常会缺少父本的信息，不利于进一步挖掘亲本遗传信息。杂交育种周期长，实验记录遗失的情况时有发生，会造成亲本信息缺失情况，从而给品种的育种谱系建立和知识产权保护带来影响[1]。因此，需要利用高多态性、高分辨率微卫星分子标记对已知亲本的杂交子代进行亲子关系准确性鉴定，为今后核桃开展大规模亲子鉴定积累技术经验。
亲子鉴定是利用生物学及分子遗传学的技术手段, 分析从子代和亲代之间的遗传物质基础的差异以及共同点等方面来分析各自的遗传特征, 判断亲代与子代之间是否具有亲缘关系的方法, 其遗传学基础是孟德尔基因分离定律和基因组自由重组的原理。目前主要有微卫星标记（Simple sequence repeats, SSR）、SNP标记和线粒体标记等主流的DNA标记方法, 其中SSR标记具有多态性丰富、杂合度高、稳定性好、共显性遗传、遵循孟德尔遗传定律、检测快速方便等优点, 在植物的亲子鉴定中得到了广泛应用[2, 3]。
以四川的核桃实生农家类型优树以及重要的栽培品种为材料，在控制授粉的条件下得到159个杂交子代，结合筛选出的12个SSR微卫星标记，分别通过基因型排除法、最大似然法两种主要的鉴定方法进行子代鉴定比较，以期推动核桃分子辅助育种的发展、良种与新品种的保护。
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研究使用的杂交组合亲本为“温185”、“盐源早”、“硕星“、“香玲”、“清香”。其中“盐源早”、“硕星“是四川本地实生农家类型筛选出来的优良地方品种（见表1）。
表 1 杂交组合及子代材料的信息
Table 1. The information of crossing combination and hybrids
编号
serial母本♀ female 父本♂ male 杂交组合子代
个体数量
No. of hybrid品种名 简写代码 品种名 简写代码 1 “香玲” D “盐源早” B 11 2 “清香” E “硕星” C 4 3 “清香” E “盐源早” B 5 4 “硕星” C “温185” A 64 5 “硕星” C “清香” E 75 -
采用CTAB法从核桃叶片中提取DNA参照王滑等[4]的方法。基因组提取DNA用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop1000 spectrophotometer紫外分光光度计检测浓度和纯度，随后将DNA 浓度稀释到工作液浓度20—50 ng·μL−1用于后续的SSR扩增分型。
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选择60对已报道的SSR引物 [5, 6]，通过5个亲本及8个子代样品进行引物筛选，选出多态性相对较高，分辨好的12对SSR引物进行DNA分析，WJR022，WJR297，WJR100，WJR281，WJR291，WJR297，WJR065，WJR226，WJR270来自普通核桃微卫星标记[5]，其他3对引物WGA-89，WGA-321，WGA-376来自黑核桃微卫星标记[6]（见表2）。PCR反应扩增和毛细管电泳参照Chen等的 [7]方法。
表 2 扩增引物序列
Table 2. Primer sequence of the amplification loci
位点
Locus引物序列（5‘-3’）正向
Primer sequence（5‘-3’）forward引物序列（5‘-3’）反向
Primer sequence（5‘-3’）reverseWJR022 ACGGGACCGGAGTTTACTTT CATGGCAGGAGAACTGGTTT WJR270 TGGTTGTAACTGTCCGCATT GGGTGATGCTAGGTTGCTTT WJR279 TTCATTACGTGGGGAAAAGC TCTTGGCTCCCATTATCTGC WJR065 CAGCCATTCGAGTTAAGACTTG TTCGATTAAGAGCTCGTTTGG WJR297 TTTCGGAAAAGCTGAGGAGA ATGTGCCTGTGGATGTGAAA WJR100 CGACGATTCGGTGAAGAAAT GAAAACCCAGTTTCTGTCGG WJR226 TCGAAGATCGATCAACGCTA GATAAGATGGATGGGTGCGT WJR281 TTCCATGGCTCTCTACCACA ATGGAGCTGGTTCCTGACAC WJR291 TTGGCACCAACACGTTAGAA TTGCAGAGATCTCATCATTTGTC WGA-89 ACCCATCTTTCACGTGTGTG TGCCTAATTAGCAATTTCCA WGA-321 TCCAATCGAAACTCCAAAGG GTCCAAAGACGATGATGGA WGA-376 GCCCTCAAAGTGATGAACGT TCATCCATATTTACCCCTTTCG -
基因型排除法鉴定，通过SSR标记扩增得到各杂交组合子代个体基因型与亲本基因型进行对比分析，双亲在特定SSR位点上具有多态性，依据孟德尔遗传规律，子代基因型为双亲互补型基因型，判别为双亲的真子代[8]。通过多个微卫星标记组合判断，均无法判定子代基因型是由亲本双方等位基因贡献，则此个体为真子代存疑。按照判定为真子代的个体数量占子代总数的比例计算鉴定率。
最大似然法鉴定，基于等位基因频率，使用CERVUS 3.0.7[9]软件对多个连锁不平衡位点通过似然性模型来预测最可能亲本或父本。软件参数如下：循环重复数10000次，父母本数量为实际数量5，亲本检测率100%，位点检测率100%，分型误差率1%，LOD置信区间95%，亲本性别未知模式。此外，采用同样的参数设置对父本未知模式进行模拟。亲子鉴定基于最大似然法的计算方法从供选亲本中预测最可能的亲本或父本。根据正取预测亲本或父本的子代个体数量占子代总数比例计算鉴定率。并利用软件GenAlex [10] 计算159子代个体和亲本遗传距离，MEGA 7.0软件构建系统进化树[11]，分析遗传多样性及遗传距离。
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利用筛选出的12对引物对159个杂交子代以及5个亲本进行扩增。结果显示，12个位点检测的等位基因数为80个，单位点等位基因数（Na）3~10个，多态信息含量（PIC）0.227~0.691；期望杂合度（He）为0.242~0.735，观测杂合度（Ho）为0.256~0.817。平均值分别为6.67、0.471、0.513、0.511。说明5个杂交组合虽然得到了大量的杂交子代，但其整体遗传多样性水平中等。无效等位基因频率F（Null）为−0.0953~0.1554，其中WJR100位点无效等位基因频率F（Null）0.08~0.20之间，亲本排除率将会被轻微低估[12]。
表 3 12个微卫星位点检测遗传多样性参数
Table 3. Genetic diversity parameters by 12 microsatellite markers
位点Locus 等位基因数Na 观察杂合度Ho 期望杂合度He 多态信息含量PIC 无效等位基因频率F（Null） WJR022 4 0.256 0.242 0.227 −0.0257 WJR279 9 0.561 0.533 0.491 −0.0203 WGA-89 7 0.652 0.716 0.665 0.041 WGA-321 6 0.232 0.236 0.229 −0.0129 WGA-376 10 0.64 0.735 0.691 0.0727 WJR100 9 0.289 0.364 0.351 0.1554 WJR281 9 0.817 0.71 0.651 −0.0773 WJR291 6 0.628 0.678 0.62 0.0366 WJR297 9 0.779 0.696 0.632 −0.0623 WJR065 5 0.366 0.362 0.347 −0.0149 WJR226 3 0.543 0.561 0.461 0.0082 WJR270 3 0.372 0.319 0.293 −0.0953 -
在159个杂交子代样本中，使用8个SSR引物鉴定出了119个真子代，其真子代总鉴定率达到76.10%。其中D×E杂交组合子代亲子鉴定率最高达到100.00%，11个样本中均鉴定出真子代；所有杂交组合后代的真子代鉴定率均达到50%以上（见表4）。微卫星位点遗传多样性检测结果显示基因型排除法所应用的引物，均为遗传多样性分析中多态信息含量（PIC）相对较高的引物，可见引物的多态信息含量（PIC）对于基因型排除法进行亲子鉴定有较大影响。
表 4 基于亲子基因型排除的真子代鉴定数量统计表
Table 4. Statistical table of identification number of true filial generation based on parent-child genotype
杂交组合 子代编码 子代个体数量 真子代鉴定数量 真子代鉴定率 主鉴定引物 辅助鉴定引物 D×B db1-11 11 11 100.00 WJR279 WGA-89、WJR294 E×C ec1-4 4 2 50.00 WJR281/WJR291 E×B eb1-5 5 4 80.00 WJR065 C×A ca1-64 64 40 62.50 WGA-89 WJR281、WJR297 C×E ce1-75 75 64 85.33 WJR281 WGA-376、WJR291、WJR297 合计 159 121 76.10 注：A、B、C、D、E分别代表‘温185’、‘盐源早’、‘硕星’、‘香玲’、‘清香’。 -
使用Cervus 3.0.7软件亲权分析功能，对159个核桃杂交子代进行亲本分析。在双亲未知的情况下，D×B子代家系的亲本鉴定率最高为72.73%；而C×A、C×E子代家系内达到显著水平的亲本鉴定率最低为0.00%，总亲本鉴定率只有7.55%；此外，控制授粉条件下，可在母本已知的情况下，对于父本进行亲权分析，D×B子代家系中11个杂交子代的亲本鉴定率最高达到90.91%，而C×A、C×E子代家系内达到显著水平的亲本鉴定率最低均未达到5%，总亲本鉴定率只有11.95%。可以看出不论双亲或父本是否已知，D×B子代家系的亲本鉴定率均是最高的，相反，亲本鉴定率均是最低的均为C×A、C×E子代家系的杂交子代（见表5）。结合等位基因频率可知，引物WJR022、WJR279、WGA-321、WJR100、WJR065、WJR270在60对备选引物中体现出相对较高的多态性。但在实际鉴定中，呈现出个别等位基因的频率过高的情况（见图1），而这些等位基因多为‘温185’（A）、‘硕星’（C）、‘清香’（E）扩增出的等位基因。说明以上五个引物对于前述三个品种存在扩增出纯合子的情况，因而通过最大似然法进行引物联合计算时降低了预测亲本的置信度，导致这三个品种作为亲本时鉴定率较低。
表 5 最大似然法鉴定亲本未知和父本未知两种情况真子代个体数量统计表
Table 5. Statistics on the number of true filial generation analyzed by maximum likelihood method under the condition of unknown parentd and unknown male parent
亲本未知 父本未知 杂交组合 个体数量 真子代个体数量 鉴定率 杂交组合 个体数量 真子代个体数量 鉴定率 D×B 11 8 72.73 D×B 11 10 90.91 E×C 4 1 25.00 E×C 4 3 75.00 E×B 5 3 60.00 E×B 5 3 60.00 C×A 64 0 0.00 C×A 64 2 3.13 C×E 75 0 0.00 C×E 75 1 1.33 合计 159 12 7.55 合计 159 19 11.95 注：A、B、C、D、E分别代表‘温185’、‘盐源早’、‘硕星’、‘香玲’、‘清香’。 
图 1 12个SSR标记等位基因频率柱状图
Figure 1. Histogram of allele frequency of 12 SSR markers
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微卫星标记是一种经济有效的亲本鉴定手段，在动物[13,14,15]及植物[16,17]的亲本鉴定中均应用广泛，在核桃研究中也能将一些遗传背景相似的栽培品种亲本鉴定出来[2, 18]。利用12对SSR引物对5个杂交组合子代进行亲子鉴定。基因型排除鉴定结果显示，单一引物对于以上品种均不具有特征带谱，多个引物相互搭配可以较好地对杂交子代进行鉴定，但基因型比较分析过程耗费了大量的人力。可见基因型排除法应用于大量的子代鉴定具有时间耗费过巨的限制。此外，‘温185’、‘香玲’一组、‘盐源早’、‘清香’一组，分别选用不同引物建立了核桃指纹图谱[19, 20]，本次试验的备选引物包含了两组核桃品种指纹图谱建立时选用的引物，但筛选时针对本次5个核桃品种同时鉴定未体现出较高的多态性而被弃选。因此，在今后工作的实际应用中，需要加大针对多数品种多态性更高的引物筛选或开发。
通过最大似然法进行计算分析，虽然很快地给出了预测结果，但其总体鉴定率较低。Mega软件分析164个亲子样本，聚类分析图显示D×B子代家系、E×B子代家系及亲本个体B、D相对聚为一组，C×A、C×E、E×C子代家系和亲本个体A、C、E相对聚为一组，组与组子代间的亲缘关系较近，没有明显的组群分类（见图2）。由于几个家系存在共享单个亲本的情况，减小了不同家系之间遗传背景的差异。相似的遗传背景导致组内不同杂交子代鉴别时极易造成亲本或父本预测的误判，这是导致鉴定率低的原因之一。此外，根据学者提出的多样性指数评价标准：PIC≤0.25，表现低度多态性，PIC0.25<PIC<0.50为中度多态性，PIC>0.50为高度多态性[21]。研究筛选出12个微卫星位点仅有4个PIC值均表现出高度多态性（见表2）。中等多态性的引物由于个别等位基因频率过高，鉴定亲本存在纯合子情况，导致引物联合计算时亲本或父本预测时置信度的降低，而无效等位基因的存在进一步降低了鉴定率。因此，应用最大似然法对多组合杂交子代进行亲子鉴定时，需要加大遗传背景相似子代的高多态性的引物开发。也需要选择或者开发高多态性的引物组合，并且剔除存在无效等位基因的引物后，才能更好地运用于大量的亲子鉴定。
图 2 164个个体聚类分析图
Figure 2. Cluster analysis diagram of 164 individuals
Parentage assignment of walnut hybrid offspring by microsatellite markers
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摘要: 杂交育种是目前核桃育种的主要方法，为了快速有效地鉴别杂交子代的真实性，加速杂交育种进程，利用微卫星标记方法辅助进行核桃亲子鉴定。研究从已发表的60对核桃属植物微卫星标记中筛选出12个多态性相对较高且稳定扩增的微卫星位点，对5个杂交组合子代159个个体通过基因型排除法和最大似然法进行亲子关系鉴定。基因型排除法鉴定出121个子代的正确亲本，鉴定率较高，总鉴定率76.10%；最大似然法亲权分析显示，双亲未知情形达到置信区间预测出正确亲本的子代有12个，总鉴定率7.55%。父本未知情形达到置信区间推算出正确亲本的子代有19个，总体鉴定率11.95%。整体鉴定率较低。Abstract: Cross breeding is the main method of walnut breeding at present. In order to identify the authenticity of cross offspring and accelerate the process of cross breeding quickly and effectively, the microsatellite marker was used to assist walnut paternity identification. In this study, 12 microsatellite loci with relatively high polymorphism and stable amplification were selected from 60 published SSR primers of walnut. The 159 offsprings from 5 hybrid combinations were identified by genotype elimination and maximum likelihood method. The correct parents of 121 progeny were identified by genotype elimination, the identification rate was high, and the total identification rate was 76.10%. The maximum likelihood parental analysis showed that 12 offspring with unknown parents reached the confidence interval predicted the correct parents, and the total identification rate was 7.55%. There were 19 progeny whose parents were correct when the confidence interval was reached, and the overall identification rate was 11.95%. The overall identification rate was low.
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表 1 杂交组合及子代材料的信息
Tab. 1 The information of crossing combination and hybrids
编号
serial母本♀ female 父本♂ male 杂交组合子代
个体数量
No. of hybrid品种名 简写代码 品种名 简写代码 1 “香玲” D “盐源早” B 11 2 “清香” E “硕星” C 4 3 “清香” E “盐源早” B 5 4 “硕星” C “温185” A 64 5 “硕星” C “清香” E 75 
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表 2 扩增引物序列
Tab. 2 Primer sequence of the amplification loci
位点
Locus引物序列（5‘-3’）正向
Primer sequence（5‘-3’）forward引物序列（5‘-3’）反向
Primer sequence（5‘-3’）reverseWJR022 ACGGGACCGGAGTTTACTTT CATGGCAGGAGAACTGGTTT WJR270 TGGTTGTAACTGTCCGCATT GGGTGATGCTAGGTTGCTTT WJR279 TTCATTACGTGGGGAAAAGC TCTTGGCTCCCATTATCTGC WJR065 CAGCCATTCGAGTTAAGACTTG TTCGATTAAGAGCTCGTTTGG WJR297 TTTCGGAAAAGCTGAGGAGA ATGTGCCTGTGGATGTGAAA WJR100 CGACGATTCGGTGAAGAAAT GAAAACCCAGTTTCTGTCGG WJR226 TCGAAGATCGATCAACGCTA GATAAGATGGATGGGTGCGT WJR281 TTCCATGGCTCTCTACCACA ATGGAGCTGGTTCCTGACAC WJR291 TTGGCACCAACACGTTAGAA TTGCAGAGATCTCATCATTTGTC WGA-89 ACCCATCTTTCACGTGTGTG TGCCTAATTAGCAATTTCCA WGA-321 TCCAATCGAAACTCCAAAGG GTCCAAAGACGATGATGGA WGA-376 GCCCTCAAAGTGATGAACGT TCATCCATATTTACCCCTTTCG
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表 3 12个微卫星位点检测遗传多样性参数
Tab. 3 Genetic diversity parameters by 12 microsatellite markers
位点Locus 等位基因数Na 观察杂合度Ho 期望杂合度He 多态信息含量PIC 无效等位基因频率F（Null） WJR022 4 0.256 0.242 0.227 −0.0257 WJR279 9 0.561 0.533 0.491 −0.0203 WGA-89 7 0.652 0.716 0.665 0.041 WGA-321 6 0.232 0.236 0.229 −0.0129 WGA-376 10 0.64 0.735 0.691 0.0727 WJR100 9 0.289 0.364 0.351 0.1554 WJR281 9 0.817 0.71 0.651 −0.0773 WJR291 6 0.628 0.678 0.62 0.0366 WJR297 9 0.779 0.696 0.632 −0.0623 WJR065 5 0.366 0.362 0.347 −0.0149 WJR226 3 0.543 0.561 0.461 0.0082 WJR270 3 0.372 0.319 0.293 −0.0953
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表 4 基于亲子基因型排除的真子代鉴定数量统计表
Tab. 4 Statistical table of identification number of true filial generation based on parent-child genotype
杂交组合 子代编码 子代个体数量 真子代鉴定数量 真子代鉴定率 主鉴定引物 辅助鉴定引物 D×B db1-11 11 11 100.00 WJR279 WGA-89、WJR294 E×C ec1-4 4 2 50.00 WJR281/WJR291 E×B eb1-5 5 4 80.00 WJR065 C×A ca1-64 64 40 62.50 WGA-89 WJR281、WJR297 C×E ce1-75 75 64 85.33 WJR281 WGA-376、WJR291、WJR297 合计 159 121 76.10 注：A、B、C、D、E分别代表‘温185’、‘盐源早’、‘硕星’、‘香玲’、‘清香’。
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表 5 最大似然法鉴定亲本未知和父本未知两种情况真子代个体数量统计表
Tab. 5 Statistics on the number of true filial generation analyzed by maximum likelihood method under the condition of unknown parentd and unknown male parent
亲本未知 父本未知 杂交组合 个体数量 真子代个体数量 鉴定率 杂交组合 个体数量 真子代个体数量 鉴定率 D×B 11 8 72.73 D×B 11 10 90.91 E×C 4 1 25.00 E×C 4 3 75.00 E×B 5 3 60.00 E×B 5 3 60.00 C×A 64 0 0.00 C×A 64 2 3.13 C×E 75 0 0.00 C×E 75 1 1.33 合计 159 12 7.55 合计 159 19 11.95 注：A、B、C、D、E分别代表‘温185’、‘盐源早’、‘硕星’、‘香玲’、‘清香’。
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