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夏枯草（Prunella vulgaris L.）为唇形科夏枯草属植物，是一种重要的多年生药用植物，在全国各地均有分布，主产于四川、陕西、甘肃、江苏、浙江、安徽、河南等省，国外主要分布在欧洲、北非、西亚、印度、北美洲等地[1]。夏枯草作为一种传统的中药，在中国有多年的使用历史。传统的中医学理论认为夏枯草味道苦涩而且辣性冷，具有消肿、抗发热和镇静的作用[2,3]。现代临床研究表明，夏枯草具有广泛的生物学效应，包括抗病毒、抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性[4-7]。除药用外，夏枯草也被应用于凉茶和食品中[8]。
研究表明，夏枯草中含有多种类型的化学成分，目前从中已分离出萜类、甾醇类、酚酸类、黄酮类、挥发油及糖类等多种化学成分[9]。迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（Rosmarinic acid-3-O-glucoside）作为夏枯草的特征成分[10,11]，已被人们广泛研究。药理学研究表明，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷都具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等[12-14]。
超声细胞破碎辅助提取是近些年来发展起来的新技术，拥有操作简单，提取时间短和溶剂消耗少的特点，已经成功应用于很多中药植物活性成分的提取[15]。本实验将超声探头直接接触植物组织与提取溶剂，对夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的提取工艺进行研究，为中药夏枯草资源的深度开发提供技术基础。
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夏枯草购于安徽亳州市大西北药业有限责任公司，经东北林业大学谷会岩教授鉴定，用粉碎机粉碎，过60~80目备用。
迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（纯度98%，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色谱级，赛莫非世尔科技(中国)有限公司），乙醇（分析级，天津市天士力化学试剂有限公司）。
高效液相色谱仪（安捷伦Agilent 1260），超声波细胞破碎仪（型号JY92-IID）。
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对迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷进行HPLC定量分析，色谱条件为：Agilent 5 TC-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，检测波长315 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，流速为1 mL·min−1；流动相体系为0.2 %磷酸-甲醇（60∶40），等度洗脱30 min。
按照上述色谱条件，配制系列浓度（0.1 mg·mL−1、0.2 mg·mL−1、0.3 mg·mL−1、0.4 mg·mL−1和0.5 mg·mL−1）的迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷对照品溶液，HPLC检测，线性拟合得到回归方程分别为：
$$ Y = {\rm{ }}58\;218x + {\rm{ }}2.0037,\;{R^2} = {\rm{ }}0.9999 $$ (1) 式中: x为对照品的浓度(mg·mL−1)，Y为峰面积
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称取夏枯草粉末0.5g，于10 mL 50%乙醇中超声提取10 min。过滤得粗提液。取粗提液2 mL过0.45 μm微孔滤膜，HPLC检测得目标产物峰面积，代入回归方程得到产物浓度。产物得率计算公式为：
$$Y = \frac{{cv}}{m}$$ (2) 式中：Y为产物的率（mg·g−1）；c为粗提液浓度（mg·mL−1）；v粗提液为体积（mL）；m为夏枯草粉末质量（g）
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根据迷迭香酸类物质的稳定性，实验选取乙醇作为提取溶剂[16]。精确称取夏枯草粉末0.5 g于容器中，在不同条件下进行超声辅助提取，计算得率。分别考察乙醇体积分数、液料比、空化时间、缓冲时间、超声功率和提取时间对目标产物得率的影响。
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准确称取夏枯草粉末0.5 g，分别加入10 mL不同体积分数的乙醇（0、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %和80 %），空化时间1.5 s，缓冲时间2.0 s，超声功率250 W，在此条件下超声提取10 min。取滤液过0.45 μm微孔滤膜，HPLC检测，计算得率。
乙醇体积分数对迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影响如图1所示，由图可见，随着乙醇体积分数的增加，目标产物迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率增长显著，但当乙醇体积分数超50%时，产物的得率有下降趋势，综合考虑，选取体积分数50 %的乙醇作为最佳浓度。
图 1 乙醇体积分数的影响
Figure 1. Effect of ethanol concentration on yield
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选用50%的乙醇作为提取溶剂，选用不同的液料比（10、15、20、25和30 mL·g−1），在250 W功率下，空化1.5 s，缓冲2.0 s，超声提取10 min。图2显示了不同液料比对产物得率的影响。由图可知，随着液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率呈递增趋势，这是由于溶剂用量的增加，物料与溶剂的接触面积增加，有利于目标产物扩散速度的提高。当液料比在增长到25 mL·g−1时，随着液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率变化不明显，因此考虑不造成溶剂的浪费，我们选择25 mL·g−1作为最佳液料比。
图 2 液料比的影响
Figure 2. Effect of liquid-solid ratio on yield
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选用50%的乙醇，25 mL·g−1的液料比，在250 W功率下考察不同超声时间（1、3、5、7、9和11 min）对目标产物得率的影响，结果如图3所示，7 min之后随着时间的增加，目标产物得率变化不显著，推测可能是由于超声探头直接与提取溶剂与物料接触，能够更充分地破坏细胞壁使目标产物释放，使其在较短的时间内达到提取完全，因此为避免造成资源的浪费，我们选取提取时间7 min作为最佳的超声时间。
图 3 超声时间的影响
Figure 3. Effect of ultrasonic irradiation time on yield
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提取溶剂为50%的乙醇，液料比为25 mL·g−1，在不同的超声功率（150 W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W和500 W）条件下空化1.5 s，缓冲2.0 s，提取7 min。目标产物得率随功率变化的趋势如图4所示，功率由150 W增加到300 W时，目标产物的得率有增加趋势，300 W之后随着功率的增加，产物得率变化不显著，推测可能是超声探头直接接触物料，避免了超声波在传输过程中能量的损耗，所以较低的功率就能够充分破坏细胞壁，因此将300 W作为最佳的超声功率。
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在超声功率300 W，超声时间7 min，液料比25 mL·g−1，提取溶剂选用50%乙醇条件下，分别考察不同空化时间（0.5~3.5 s）、不同缓冲时间（0.5~3.5 s）对目标产物得率的影响。不同空化时间对产物得率的影响如图5所示，0.5 s至1.5 s目标产物得率有增加趋势，1.5 s之后，随着空化时间的增加，目标产物的得率变化不显著，考虑到能耗的因素，因此我们选择空化时间1.5 s作为最佳条件。
图 4 超声功率的影响
Figure 4. Effect of ultrasonic irradiation power on yield
图 5 空化时间的影响
Figure 5. Effect of cavitation time on yield
图6显示了不同缓冲时间对迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影响。如图所示，缓冲时间在0.5~2.0 s时间范围内，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率有增加趋势，2.0 s之后，随着缓冲时间的增加，目标产物的得率有降低趋势，推测可能是随着缓冲时间增加，同一提取过程中空化时间减少，降低了目标产物向溶剂的扩散，从而导致得率的降低。因此，我们选择2.0 s作为最佳缓冲时间。
图 6 缓冲时间的影响
Figure 6. Effect of buffer time on yield
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实验选用乙醇作为提取剂，通过单因素实验得到超声细胞破碎辅助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的最佳提取工艺：乙醇体积分数50%，液料比25 mL·g−1，空化时间1.5 s，缓冲时间2.0 s，超声功率300 W，提取时间7 min，在最佳条件下迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率为0.71 mg·g−1。超声细胞破碎辅助提取在常温下就可进行，具有提取效率高、时间短、绿色环保的优点。
Ultrasonic-Assisted Extraction of Rosmarinic Acid-3-O-glucoside from the Fruit-spikes of Prunella vulgaris L.
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摘要: 研究以夏枯草果穗为原料，采用超声细胞破碎辅助提取夏枯草中的迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷，通过高效液相色谱法进行定量分析，得到的最佳提取条件为以50%乙醇为提取剂，液料比25 mL·g−1，空化时间1.5 s，缓冲时间2.0 s，超声功率300 W，超声时间7 min，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率为0.71 mg·g−1。与传统提取方法相比，超声法具有稳定、高效、节能的优点。
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关键词:
- 夏枯草;
- 超声辅助提取;
- 迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷
Abstract: In this study, the fruit-spikes of Prunella vulgaris L. were used as raw materials to extract rosmarinic acid-3-O-glucoside by ultrasonic cell grinder extraction and the content was determined by HPLC. Through the investigation of various factors, the best extraction conditions were as follows: 50% ethanol as extraction agent, liquid-solid ratio of 25 mL·g−1, cavitation time of 1.5 s, buffer time of 2.0 s, ultrasonic irradiation power of 300 W, ultrasonic irradiation time of 7 min. Under the optimum conditions, the yield of rosmarinic acid-3-O-glucoside was 0.71 mg·g−1. Compared with the traditional extraction method, ultrasonic-assisted extraction has the advantages of stability, high efficiency and energy saving. -
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图(6)
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