金线莲为兰科开唇兰属（Anoectochilus）多年生珍稀中草药。据中国植物志记载我国有20种，2变种，产于我国西南部至南部^[1]。另外根据多数学者的研究，认为开唇兰属和齿唇兰属（Odontochilus）在形态上区别比较小，主张将齿唇兰属合并入开唇兰属^[1]。近些年金线莲作为药用植物盛于闽台，在当地有“药中之王”的美称，又被人称为“鸟人参”，民间治疗范围极广^[2]。据《福建药物志》记载其性味平、甘，清热凉血、祛风利湿，主治咯血、支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病，乳糜尿，血尿，风湿性关节炎，小儿急惊风，毒蛇咬伤等^[3-5]。而据《中国本草原色图谱》记载台湾金线莲性味性平微寒, 味甘微苦无毒，入肝肺胃心脾诸经，功能具解热、清火退火降血压功能, 主疗肝脾病，肺肿病, 遗精遗漏诸病, 兼治胸痛胰痛咳嗽血虚血热吐血, 肝火小儿发育不良及毒蛇咬伤等^[3,6]。目前金线莲的药用及商用价值逐渐被人们认可，逐渐由闽台地区向全国其他省份发展，许多地区都有开发种植。现在市场最多的商品开发种主要为常被称作福建金线莲的花叶开唇兰（A. roxburghii）和常被市场称为银线莲的台湾开唇兰（A. formosanus）^[2]。前期调查研究发现在广西、浙江、云南、四川、贵州等地都有野生种群也有被开发销售，常见的种有峨眉金线兰（Anoectochilus emeiensis）、浙江金线兰（A. zhejiangensis）、滇越金线兰（A. chapaensis）、滇南开唇兰（A. burmannicus）等。生产销售中常把上述不同种不同产地的金线莲统称为金线莲^[2]。

峨眉金线莲的研究较少，目前有报道的有峨眉金线莲的组织培养等方面的工作^[2,7]。金线莲遗传多样性的研究在福建金线莲中已有研究，但峨眉金线莲此方面的工作仍属空白，因此亟需开展此方面的研究。近些年各种分子标记技术的快速发展为开展峨眉金线莲的遗传多样性研究提供了很好的支持，其中ISSR分子标记技术在福建金线莲和台湾金线莲不同种群，不同产地，不同品系的鉴定等方面都表现出了较好的结果，但在峨眉金线莲中还未得到验证。

ISSR分子标记技术基于PCR扩增，使用微卫星引物产生多态位点标记的技术，相比较于其他分子标记手段具有操作简单、多态性高、重复性高的优点且不需要预知基因组序列^[8-11]。近些年在多种植物中ISSR的实验技术在遗传多样性的分析中发挥了比较重要的作用^[12-15]。研究拟对影响峨眉金线莲ISSR-PCR反应体系的5个因素（Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg²⁺，引物和DNA模板含量）利用正交试验设计进行优化分析，另外对优化后的体系通过梯度PCR的方法筛选退火温度（Tm），以解决由于ISSR实验中引物序列单一多种因素会干扰实验结果的问题，从而可以建立峨眉金线莲种群遗传多样性ISSR-PCR的最佳反应体系。

1.   实验材料

所用试验所用的峨眉金线莲（A. roxburghii）材料皆是2015年野外采集的野生资源，移植在峨眉山生物资源实验站种质资源圃内。同时采集不同种群的蒴果以常规组培方法进行组织培养，所用配方参考鲁松等^[7]。待成苗长至8 cm左右采集其成熟叶片用作体系优化、退火温度筛选等。引物由哥伦比亚大学公布的ISSR反应体系引物序列中选择，所选择的引物序列为ISSR834，由成都擎科生物科技有限公司合成，序列为∶5'-AGAGAGAGAGAGAGAGYT-3'。DNA提取所用的常规生物耗材购自成都科龙化工有限公司，PCR体系构建所需的酶、DL2000 DNA Marker及电泳验证所用的琼脂糖等均购自TaKaRa 公司。

2.   实验方法

2.1   DNA提取

峨眉金线莲叶片DNA 的提取采用改良CTAB 法及采用天根生化科技有限公司的植物总DNA提取试剂盒提取，用核酸蛋白含量测定仪和10 g·L⁻¹琼脂糖电泳检测DNA浓度和纯度，凝胶成像系统观察提取结果，然后将符合试验要求的模板DNA浓度稀释为10 ng/μL，储存于−20°C冰箱中冷藏备用。所用检测凝胶成像系统及后续PCR扩增结果分析所用凝胶成像系统均为Gel Doc EZ Imager（Bio-Rad）。

2.2   PCR扩增与体系正交实验

正交试验采用5因素4水平的设计进行筛选L16 （4⁵），对引物ISSR834、Taq 酶浓度、模板DNA含量、dNTPs、Mg²⁺进行筛选，具体含量见表1和表2。采用总体积为25 μL的反应体系，包含了2 μL的10× PCR Buffer， ddH₂O 补足最终体积。本实验中应用了Bio-Rad公司的C1000 Touch Thermal Cycler型号PCR仪。其反应程序设置为：94°C，变性5 min；94°C，变性45 s；53°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45个循环；72°C，变性10 min。利用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶成像系统拍照分析。之后对电泳结果进行分析，其中电泳条带数量最多、清晰度高和背景低的最佳组合记16分，最差组合记1分，统计各个组合的评分数，然后对评分进行极差分析^[10-11]。

表  1  ISSR-PCR反应体系正交设计因素及水平

Table  1.  Level of ISSR-PCR system factors in orthogonal design

水平Level	影响因素（Factors）
	Taq DNA polymerase/U	Mg2+/（mmol·L−1）	dNTPs/（mmol·L−1）	Primer/（µmol·L−1）	DNA/ng
1	0.8	1.00	0.10	0.20	10.00
2	1.20	1.25	0.20	0.25	20.00
3	1.60	1.50	0.30	0.30	30.00
4	2.00	2.00	0.40	0.40	40.00

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2.3   退火温度（Tm）的确定

采用德国Eppendorf Mastercycler X50梯度PCR仪梯度进行最佳退火温度（Tm）的确定，设定退火温度为50°C~60°C，采用上述正交试验中筛选出的最优反应体系，对Tm进行梯度测验。由PCR仪自动生成7个温度梯度^[10,11]。

2.4   对优化的ISSR-PCR扩增体系的验证

根据实验分析结果，获得最佳反应体系和最适退火温度（Tm），用引物ISSR834对12份不同种群的野生峨眉金线莲材料进行ISSR-PCR扩增，从而验证最终的ISSR优化扩增体系。

3.   结果与分析

3.1   ISSR-PCR 扩增结果分析

图1-a为本实验16个ISSR-PCR正交试验的结果，由图可见，不同的处理间DNA模板含量、Taq 酶的浓度、dNTPs及Mg²⁺的浓度不同而导致PCR试验的扩增结果有比较明显的差异，主要表现在扩增条带的多态性、特异性、亮度及清晰度等方面。在16个反应体系中，多态性低而且主带不是很明显的有组合1、2、3、10和14；部分条带背景界限模糊、有些条带比较微弱的组合有5、11、12、13及16；条带强度比较高、多态性好、且条带界限比较分明的是组合4与7；其中按照评分标准，评分最高的是组合4，由图可见其条带明亮的最多、界限比较明显，多态性最好。综合各种因素，最终得到的峨眉金线莲ISSR-PCR正交试验总体积25 μL的最佳反应体系中各成分的组成为：2.0 μL 10× Buffer、40 ng DNA模板、0.4 μmol·L⁻¹引物、0.4 mmol·L⁻¹ dNTPs、2.0 mmol·L⁻¹ Mg²⁺及0.8 U Taq DNA 聚合酶。

图  1  1-a：峨眉金线莲ISSR-PCR正交试验电泳图；1-b：引物834退火温度筛选；1-c:引物834对12份峨眉金线莲的ISSR-PCR扩增

注：M：Marker DL2000；箭头所示差异条带。

Figure  1.  Fig.1-a: Electrophoresis diagram of ISSR-PCR orthogonal test of Anoectochilus omeiensis; 1-b：Selection of annealing temperature of primer 834; 1-c: ISSR-PCR amplification of 12 Anoectochilus omeiensis samples with primer 834.

Note: M: Marker DL2000; The arrows show the difference strip。

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3.2   极差分析

表2为峨眉金线莲ISSR-PCR实验以834为引物的各因素的极差分析结果，表明各因素对PCR扩增体系的影响程度和极差的大小成正比。不同因素的影响程度从引物的浓度、TaqDNA聚合酶含量、Mg²⁺含量、DNA模板的浓度、dNTPs依次从大到小排列。扩增结果最为理想，评分最高的为组合4。

表  2  ISSR-PCR 反应体系L₁₆（4⁵）正交设计及直观分析表

Table  2.  L₁₆（4⁵） orthagonal design for ISSR-PCR and intuitive analysis

组合 Number	影响因素Factors					分值 Test Scores
	Taq DNA polymerase/U	Mg2+/（mmol·L−1）	dNTPs/（mmol·L−1）	Primer/（µmol·L−1）	DNA/ng
1	0.8	1.00	0.10	0.20	10.00	1.5
2	0.8	1.25	0.20	0.25	20.00	10
3	0.8	1.50	0.30	0.30	30.00	2
4	0.8	2.00	0.40	0.40	40.00	15
5	1.2	1.00	0.20	0.30	40.00	8
6	1.2	1.25	0.10	0.40	30.00	10
7	1.2	1.50	0.40	0.20	20.00	14
8	1.2	2.00	0.30	0.25	10.00	12
9	1.6	1.00	0.30	0.40	20.00	8
10	1.6	1.25	0.40	0.30	10.00	2
11	1.6	1.50	0.10	0.25	40.00	10
12	1.6	2.00	0.20	0.20	30.00	6
13	2.0	1.00	0.40	0.25	30.00	6
14	2.0	1.25	0.30	0.20	40.00	2.5
15	2.0	1.50	0.20	0.40	10.00	10
16	2.0	2.00	0.10	0.30	20.00	8
均值1 Mean1	7.125	5.875	7.375	6	6.375
均值2 Mean2	11	6.125	8.5	9.5	10
均值3 Mean3	6.5	9	6.125	5	6
均值4 Mean4	6.625	10.25	9.25	10.75	8.875
极差 Range	4.5	4.375	3.125	5.75	4

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3.3   退火温度（Tm）的优化结果

图1-b为以上述组合4的体系即最佳PCR反应体系的正交试验结果，以834为引物，进行最佳退火温度（Tm）的筛选。表明在50°C~60°C的温度梯度范围内，PCR实验结果随着退火温度的不同而有不同的表现。且随着退火温度的逐渐升高，部分扩增条带逐渐清晰，而且界限比较明显，数量也逐渐增多，在退火温度为56.5°C时扩增的结果表现最好，而超过56.5°C后部分条带逐渐转弱，数量变少，在最高温度60°C时无扩增条带出现，而在退火温度较低的情况下，部分条带较暗，数量较少。因此，峨眉金线莲ISSR-PCR扩增实验的最佳退火温度为56.5°C。综上，将扩增程序确定为：94°C，变性5 min；94°C，变性45 s；56.5°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45个循环；72°C，变性10 min。

3.4   最佳反应体系的验证

由图1-c所示，采用引物ISSR834对其他12份不同种群的峨眉金线莲种质材料进行了扩增，以验证和检测上述优化的峨眉金线莲ISSR-PCR反应体系和最佳退火温度。结果表明，12个不同种群的野生峨眉金线莲叶片DNA为模板的实验扩增条带均能够表现出非特异性扩增条带比较少、清晰明显、界限分明、多态性高的特点。这证明了本实验优化的体系有较强的稳定性和较高的可靠性，该体系可以用于后续的峨眉金线莲及开唇兰属植物的野外种群的遗传多样性分析研究。同时将该体系应用于其他引物，如807，811，822，827，841等，除重新优化退火温度外，该体系的扩增都获得了良好的效果。

3.5   834引物对不同种群的鉴定结果

引物834（见图1-c）对峨眉金线莲12个野生种群的分析结果显示共具有4条多态性条带，分别位于1600 bp、1450 bp、860 bp及630 bp。其中1450 bp条带为种群2所特有，而1600 bp为种群1和2所特有，860 bp条带为种群8所特有，630 bp条带可以较好地把12个种群分为两大组1，2，6，8等为一组，剩余地8个种群为一组。且上述4个条带强度都较强。另外630 bp条带两大组中1，2，6，8组样品皆表现为圆叶型，其余8组皆表现为椭圆且带急尖型叶，就上述12个种群的分析看630 bp为圆叶种群的特有条带。综合分析来看834引物在峨眉金线莲野生种群的扩增条带多态性较高，可以用于后续不同种群不同表型的峨眉金线莲种群的遗传多样性分析。

4.   讨论

ISSR-PCR的实验方法，通常以1-4个碱基串联组成的16-18个重复微卫星序列和几个非重复的锚定碱基为引物，提高了PCＲ扩增反应的专一性，同时又具有成本低、稳定性及重复性好等特点，能比较好地揭示实验物种地遗传多样性特点，故而被很多科研人员采用。但是作为一种基于PCR的分子标记实验技术，其实验结果往往会受到多种因素的影响，而且在不同科属的植物中也有比较大的差异，甚至同一属不同种之间都会有很大的不同。在用ISSR-PCR的实验方法进行遗传多样性分析时常常需要获得适合不同植物扩增的最优反应体系。单因素和正交试验设计相结合的方法常被用来优化ISSR-PCR的反应体系，近些年此类的研究较多。其中常采用梯度试验的方法来进行单因素试验设计，以探索单个因素的最适条件，如张福生等之前对金线莲的ISSR-PCR最佳反应体系优化就采用了此种方法^[9,11,16]。但此种方法需要扩增多次，所需时间精力较大，会增加不少成本而且不能兼顾考察各个因素之间的交互影响。因此许多学者采用正交试验的设计方法来探索最优体系，如唐军荣等就采用了此种方法来探索金线莲的最优ISSR-PCR反应体系^[17]，此种方法可以兼顾各个影响因子的交互作用，许多研究人员在多种植物中都采用了此种方法来探索ISSR的最优体系，如：唐楠等在白芥（Sinapis alba），黄晓慧等在兰属（Cymbidium），陈云霞等在银缕梅（Shaniodendron subaequale），刘玲在桑属（Morus），田霞在葛缕子（Carum carvi）等植物中都采用了此法^[18-22]。

根据极差分析结果，引物浓度是影响峨眉金线莲ISSR-PCR扩增结果最大的因素，这与陈云霞等在银缕梅，朱成豪等在鳞尾木（Lepionurus sylvestris），钱前等在黑果枸杞（Lycium ruthenicum）中的结果一致^[20,23,24]，引物的浓度高低对PCR扩增产物的产量及PCR反应的特异性都有影响。这个结果与唐军荣等在金线莲中的结果不一致，他们的结果显示Taq酶的浓度是影响因素最大的。本实验中Taq酶对峨眉金线莲ISSR-PCR扩增结果的影响仅次于引物浓度，Taq酶在PCR实验中往往关系着实验的成败，是扩增反应的催化剂，其浓度的高低会影响扩增效率及非特异性条带的产生，如彭慧等在异鳞石山棕（Guihaia heterosquama），经建永等在欧洲李（Prunus domestica），唐雨晨等在藜芦（Veratrum nigrum），高慧新等在褐苞薯蓣（Dioscorea persimilis）中都发现Taq酶的浓度是影响因素最大的^[14,25-27]。Mg²⁺浓度的影响在本实验中次于Taq酶，Mg²⁺浓度的大小会对PCR扩增产物产生直接的影响，其浓度的高低一是可以影响酶的活性，另外还可以影响DNA模板与引物结合的效率，如郭傲等在无花果（Ficus carica），任雪羽等在木槿（Hibiscus syriacus），陈曦等在蓝花丹（Plumbago auriculata），田霞等在藏茴香（Carum carvi）中都发现Mg²⁺浓度的大小是影响ISSR-PCR扩增效果最大的因素^{[15,22,28,29]}。DNA模板的含量及质量也关系着PCR实验的成败，但在本实验的极差分析结果显示其影响相对较小，这与黄晓慧等在兰属，丁雯等在酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa），黄旭萍等在山乌桕（Triadica cochinchinensis ），刘玲等在桑属（Morus）中都发现DNA模板浓度的高低是影响ISSR-PCR扩增效果最大的因素的结果不同^{[12,19,21,30]}。相比较于其他因素，dNTPs的含量在峨眉金线莲ISSR-PCR极差分析值最小，dNTPs是ISSR-PCR反应的原材料之一，其浓度的高低可以影响PCR的错配及产物的合成效率，唐楠等在白芥，林丹等在云南沉香（Aquilaria yunnanensis），罗湘等在龙珠果（Passiflora foetida），张婉茹等在稗草（Echinochloa crusgalli）中都发现dNTPs浓度的高低是最大的影响因素^{[13,18,31,32]}。

引物的退火温度（Tm）是影响扩增反应的另一重要因素^[33]，本实验最终确定了引物834在峨眉金线莲的ISSR-PCR反应中的最适退火温度为56.5°C，适宜的引物退火温度显著增加扩增条带数，条带的清晰度及特异性。这与张福生等的结果不同，可能与所采用的不同种材料有关。

综上所述，利用5因素4水平的正交实验探讨了各因素的不同水平对峨眉金线莲ISSR-PCR反应结果的影响，建立了稳定且重复性好的ISSR-PCR反应体系，即在25 μL体系中含：40 ng DNA模板、0.4 μmol·L⁻¹引物、0.4 mmol·L⁻¹ dNTPs、2.0 mmol·L⁻¹ Mg²⁺、0.8 U Taq DNA 聚合酶、2.0 μL 10× Buffer。同时筛选了最适的退火温度（Tm），提出适合峨眉金线莲的ISSR-PCR实验程序为：94°C，变性5 min；94°C，变性45 s；56.5°C，退火45 s；72°C，延伸1 min 45 s，共45个循环；72°C，变性10 min。该体系对以ISSR分子标记为手段来分析峨眉金线莲的野生种群的遗传多样性提供了基础，同时也为同属的其他植物有参考价值。