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油樟高产1,8-桉叶油素内生细菌发酵条件优化

王鑫 魏琴 莫开林

王鑫, 魏琴, 莫开林. 油樟高产1,8-桉叶油素内生细菌发酵条件优化[J]. 四川林业科技, 2021, 42(5): 69−72 doi: 10.12172/202102040003
引用本文: 王鑫, 魏琴, 莫开林. 油樟高产1,8-桉叶油素内生细菌发酵条件优化[J]. 四川林业科技, 2021, 42(5): 69−72 doi: 10.12172/202102040003
Wang X, Wei Q, Mo K L. Optimization of fermentation conditions of endophytic bacteria with high yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2021, 42(5): 69−72 doi: 10.12172/202102040003
Citation: Wang X, Wei Q, Mo K L. Optimization of fermentation conditions of endophytic bacteria with high yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2021, 42(5): 69−72 doi: 10.12172/202102040003

油樟高产1,8-桉叶油素内生细菌发酵条件优化


doi: 10.12172/202102040003
详细信息
    作者简介:

    王鑫(1997—),男,学士,17780318914@qq.com

    通讯作者: 249300824@qq.com(魏琴); mokailin@126.com(莫开林)
  • 基金项目:  四川省科技基础条件平台项目(2018TJPT0035);四川省科技计划项目(2019YFN0029,2019YFSY0002)

Optimization of Fermentation Conditions of Endophytic Bacteria with High Yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum

More Information
    Corresponding author: 249300824@qq.com(WEI Qin); mokailin@126.com(MO Kailin)
  • 图(1) / 表(2)
    计量
    • 文章访问数:  236
    • HTML全文浏览量:  73
    • PDF下载量:  7
    • 被引次数: 0
    出版历程
    • 收稿日期:  2021-02-04
    • 网络出版日期:  2021-07-15
    • 刊出日期:  2021-09-30

    油樟高产1,8-桉叶油素内生细菌发酵条件优化

    doi: 10.12172/202102040003
    基金项目:  四川省科技基础条件平台项目(2018TJPT0035);四川省科技计划项目(2019YFN0029,2019YFSY0002)

    摘要: 本研究通过设计单因素试验对发酵条件进行优化,以期提高目标菌株的1, 8-桉叶油素产量。结果表明,1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵的工艺条件为:发酵温度为31 ℃、发酵转速(溶氧)为150 r·min−1、发酵pH值为6.5、发酵时间为20 h。产量由未优化时的2.30 mg·L−1增长至9.68 mg·L−1,增长率为320.8%,具有良好的应用前景。

    English Abstract

    • 油樟,学名Cinnamomum longipaniculatum (Gamble) N.Chao ex H.W.Li,是我国能够生产天然芳香油的特有树种,该树种于1974年由四川省林业科学院森林植物分类专家赵良能发现并命名[1]。油樟精油中含55%以上的1,8-桉叶油素,1,8-桉叶油素应用面广,需求量大,但从香料植物油樟中提取收原材料资源限制,其产量有限。因此,探索一种使用油樟内生细菌通过发酵工程直接生产1,8-桉叶油素的生产工艺具有较广阔的研究空间。本文在前期筛选出高产1,8-桉叶油素油樟内生细菌的基础上[2,3],对发酵条件优化做了一个较为系统的研究,优选出1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件,为发酵工程人工生产1,8-桉叶油素奠定基础。

      • 油樟1,8-桉叶油素内生细菌,自制。

      • 表 1  药品试剂

        Table 1.  Pharmaceutical reagents

        药物名称生产厂家
        盐酸(分析纯)四川西陇化学试剂有限公司
        氢氧化钠(分析纯)成都市科隆化学品有限公司
        次氯酸钠(分析纯)成都长联化工试剂有限公司
        乙醇95%(分析纯)成都市科隆化学品有限公司
        丙三醇(分析纯)成都长联化工试剂有限公司
        无水硫酸镁(分析纯)四川西陇化学试剂有限公司
        LB琼脂成品培养基杭州百思生物技术有限公司
        LB液体成品培养基杭州百思生物技术有限公司
        细菌DNA提取试剂盒生工生物工程(上海)有限公司
        胰酪大豆胨琼脂(TSA)杭州百思生物科技有限公司
        卵磷脂-吐温80琼脂杭州百思生物科技有限公司
        二氯甲烷(色谱纯)成都市科隆化学品有限公司
        正己烷(色谱纯)成都市科隆化学品有限公司
        丙酮(色谱纯)成都市科隆化学品有限公司
        1,8-桉叶油素标准样品香料与发酵重点实验室提供
      • 表 2  主要仪器

        Table 2.  Main equipments

        仪器与设备设备型号生产厂家
        超净工作台SW-CJ-2FD苏州安泰空气技术有限公司
        精密鼓风干燥箱GZX-GF101-3-BS-II上海一恒科学仪器有限公司
        生化培养箱SPX-250-II上海跃进医疗器械厂
        多频率超声波清洗机SB-600DTY宁波新芝生物科技股份有限公司
        恒温水浴锅HHW21.600S上海龙跃仪器设备有限公司
        数显型圆周摇床LYZ-211B上海龙跃仪器设备有限公司
        全自动高压蒸汽灭菌锅MLS-3781L-PC深圳市赛亚泰科仪器有限公司
        96孔深孔PCR仪Bio-rad S1000伯乐生命医学(上海)有限公司
        精密pH计PHSJ-5上海精密科学仪器有限公司
        分析天平JA2003上海舜宇恒平科学仪器有限公司
        气相色谱-质谱联用仪Agilent7890A-5975CAgilent Technologies
      • 取15个100 mL锥形瓶,超声波清洗干净,70 ℃烘干备用。每个锥形瓶冷却至室温,分别加入40 mL LB液体培养基,封口膜覆盖、橡皮筋缠绕密封,置于高压灭菌锅设置温度121 ℃、灭菌时间20 min,灭菌结束后取出锥形瓶,置于超净工作台紫外线照射冷却至室温。设置发酵时间为五个梯度水平,即10 h、15 h、20 h、25 h、30 h,无菌条件下接种目标菌株,置于35 ℃,140 r·min−1恒温摇床培养箱中按发酵时间梯度分别进行发酵,每一个发酵时间水平内发酵3个锥形瓶,作为平行实验。发酵完成后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵温度。

      • 对发酵培养转速优选的实验设计5个梯度,即转速为120 r·min−1、130 r·min−1、140 r·min−1、150 r·min−1、160 r·min−1。在筛选出的发酵时间为20 h的基础上,每个转速梯度设置3个平行。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵培养转速。

      • 对发酵pH值优选的实验设计5个梯度,pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1的基础上,每个pH值梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵pH值。

      • 对发酵温度优选的实验设计5个梯度,即29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1、发酵pH为6.5的基础上,每个温度梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵温度。

      • 本试验数据用Excel 2016软件和SPSS软件进行分析。

      • 以不同的发酵时间为基础进行的发酵时间优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(a)所示。以5个梯度水平的发酵时间对目标菌株进行发酵时间优化,随着发酵时间增加,产量由最开始的10 h时1.80 mg·L−1开始呈现稳定上升趋势,在发酵时间为20 h时,1,8-桉叶油素产量达到最高为2.67 mg·L−1,发酵时间继续延长,当超过20 h后,其产量显著降低。因此发酵时间过短或者过长,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵时间确定为20 h最为适宜。

        图  1  发酵工艺条件对产量的影响

        Figure 1.  Effect of fermentation conditions on yield

      • 以不同的发酵培养转速为基础进行的发酵转速优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(b)所示。以5个梯度水平的发酵培养转速对目标菌株进行发酵条件优化,随着发酵培养转速增加,产量由最低的120 r·min−1时1.08 mg·L−1开始呈现稳定上升趋势,在150 r·min−1时达到最高产量3.08 mg·L−1,当发酵培养转速超过150 r·min−1后,产量显著降低。因此发酵培养转速过低或者过高,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵培养转速确定为150 r·min−1最为适宜。

      • 以不同的发酵pH值为基础进行的发酵pH值优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(c)所示。以5个梯度水平的发酵pH值对目标菌株进行发酵条件优化,随着发酵pH值增加,产量由初始的pH值=6.0时2.00 mg·L−1呈现上升趋势,在pH值=6.5时达到最高产量6.53 mg·L−1,当发酵pH值超过6.5后,产量显著降低并趋于稳定。因此发酵pH值过低或者过高,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵pH值确定为6.5最为适宜。

      • 以不同的发酵温度为基础进行的发酵温度优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(d)所示。以5个梯度水平的发酵温度对目标菌株进行发酵条件优化,随着发酵温度增加,产量由初始的温度29 ℃时5.26 mg·L−1呈现为上升趋势,在31 ℃时达到最高产量9.68 mg·L−1,当发酵温度超过31 ℃后,产量显著降低并趋于稳定。因此发酵温度过低或者过高,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵温度确定为31 ℃最为适宜。

      • 本研究通过单因素优化实验,确定了油樟1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件工艺参数为:发酵温度为31 ℃、发酵转速(溶氧)为150 r·min−1、发酵为pH值6.5、发酵时间为20 h。在单因素优化实验筛选出的最佳发酵条件下,产量由未优化时的2.30 mg·L−1增长至9.68 mg·L−1,产量增长率为320.8%。

    参考文献 (3)

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