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成都麻羊种群微卫星标记遗传多样性评估

余姣姣 刘家斌 徐永涛 吴永胜 杨雪 齐桂兰

余姣姣, 刘家斌, 徐永涛, 等. 成都麻羊种群微卫星标记遗传多样性评估[J]. 四川林业科技, 2021, 42(1): 130−136 doi: 10.12172/202006300002
引用本文: 余姣姣, 刘家斌, 徐永涛, 等. 成都麻羊种群微卫星标记遗传多样性评估[J]. 四川林业科技, 2021, 42(1): 130−136 doi: 10.12172/202006300002
Yu J J, Liu J B, Xu Y T, et al. Genetic diversity assessment of Chengdu gray goat based on microsatellite markers[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2021, 42(1): 130−136 doi: 10.12172/202006300002
Citation: Yu J J, Liu J B, Xu Y T, et al. Genetic diversity assessment of Chengdu gray goat based on microsatellite markers[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2021, 42(1): 130−136 doi: 10.12172/202006300002

成都麻羊种群微卫星标记遗传多样性评估


doi: 10.12172/202006300002
详细信息
    作者简介:

    余姣姣(1990—),女,助理研究员,硕士,847915469@qq.com

    通讯作者: 497006351@qq.com
  • 基金项目:  四川省科技厅重大专项(2018SZDZX0037);国家现代农业产业技术体系四川肉羊创新团队肉羊养殖与环境控制技术研发集成与应用岗位(2060302)

Genetic Diversity Assessment of Chengdu Gray Goat Based on Microsatellite Markers

More Information
    Corresponding author: 497006351@qq.com
  • 摘要: 作为优良的地方山羊品种,成都麻羊对我国山羊品种的改良和新品种培育起了重要作用。畜禽遗传资源本质上是基因资源,保护畜禽遗传资源就是保护基因的多样性。为了了解成都麻羊的遗传情况,通过微卫星标记技术,选用8对中高度多态微卫星标记进行成都麻羊圈养种群的遗传多样性评估,共检测到60个等位基因,平均等位基因和平均有效等位基因数分别为7.5、2.36,平均观察杂合度、平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.577、0.634和0.580。研究结果表明成都麻羊种群遗传多样性较高,具有较高的保种潜力。
  • 图  1  微卫星标记位点的等位基因分布

    Fig.  1  Allele frequency of microsatellite markers

    表  1  本研究所用微卫星DNA标记

    Tab.  1  Microsatellite DNA markers were used in this study

    微卫星位点引物序列(5′-3′)5′端修饰退火温度/℃
    ILSTS004F: CTTAAAATCTGTCTTTCTTCC5`6-FAM48
    R:TAGTGTGTATTGGTTTCTCC
    INRA063F: ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC5`HEX52
    R:AAACCACAGAAATGCTTGGAAG
    OarFCB011F: GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC5`6-FAM54
    R:GGCCTGAACTCACAAGTTGATATATCTATCAC
    ILSTS030F: CTGCAGTTCTGCATATGTGG5`HEX54
    R:CTTAGACAACAGGGGTTTGG
    SR-CRSP-1F: TGCAAGAAGTTTTTCCAGAGC5`HEX54
    R:GTACCCTGGTTTCACAAAAGG
    SR-CRSP-5F: GGACTCTACCAACTGAGCTACAAG5`6-FAM54
    R:TTATGAAATGAAGCTAAAGCAATGC
    ILSTS033F: TATTAGAGGATGGATGCTAAACT5`HEX52
    R:CTGCAAATAAGAAAACTGAATAAA
    OarFCB48F: GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC5`HEX54
    R:GACTCTAGAGGTACGCAAAGAACCAG
    McM038F: TGGTGAATGGTGCTCTCATACCAG5`HEX54
    R:CAGCCAGCAGCCTCTAAAGGAC
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    表  2  9个微卫星标记位点多态性检测结果

    Tab.  2  Polymorphism detection results of 9 microsatellite markers

    微卫星位点kNHoHePICF(Null)
    ILSTS0045310.4520.4350.404−0.0615
    INRA0635310.5160.6540.5980.1032
    OarFCB0114320.5940.6290.551−0.0297
    ILSTS0306320.8130.6850.633−0.0991
    SR-CRSP-13320.2500.2260.226−0.0608
    SR-CRSP-57320.5940.5910.591−0.0116
    ILSTS0335290.4140.4590.4590.0122
    OarFCB486310.8390.7660.766−0.0582
    McM0383310.4520.4100.410−0.0721
      注:k表示等位基因数,N表示DNA样品量,Ho表示观察杂合度,He表示期望杂合度,PIC表示多态信息含量
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    表  3  圈养成都麻羊种群遗传多样性情况

    Tab.  3  Genetic diversity of captive Chengdu gray goat population

    微卫星标记kNHoHePICHWEF(Null)
    ILSTS004112600.5650.6100.585NS0.0367
    INRA06352540.5940.6750.622NS0.0579
    OarFCB01182600.5310.6350.565NS0.0900
    ILSTS03072670.7040.6960.656NS−0.0110
    SR-CRSP-582610.5980.6140.567NS0.0063
    ILSTS03372620.4430.4910.468NS0.0500
    OarFCB4892560.7700.7770.743NS0.0037
    McM03852640.4130.4930.432NS0.0815
      注:k表示等位基因数,N表示DNA样品量,Ho表示观察杂合度,He表示期望杂合度,PIC表示多态信息含量,HWE表示哈代-温伯格平衡
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    出版历程
    • 收稿日期:  2020-06-30
    • 网络出版日期:  2020-12-22
    • 刊出日期:  2021-02-04

    成都麻羊种群微卫星标记遗传多样性评估

    doi: 10.12172/202006300002
      作者简介:

      余姣姣(1990—),女,助理研究员,硕士,847915469@qq.com

      通讯作者: 497006351@qq.com
    基金项目:  四川省科技厅重大专项(2018SZDZX0037);国家现代农业产业技术体系四川肉羊创新团队肉羊养殖与环境控制技术研发集成与应用岗位(2060302)

    摘要: 作为优良的地方山羊品种,成都麻羊对我国山羊品种的改良和新品种培育起了重要作用。畜禽遗传资源本质上是基因资源,保护畜禽遗传资源就是保护基因的多样性。为了了解成都麻羊的遗传情况,通过微卫星标记技术,选用8对中高度多态微卫星标记进行成都麻羊圈养种群的遗传多样性评估,共检测到60个等位基因,平均等位基因和平均有效等位基因数分别为7.5、2.36,平均观察杂合度、平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.577、0.634和0.580。研究结果表明成都麻羊种群遗传多样性较高,具有较高的保种潜力。

    English Abstract

    • 成都麻羊,又名四川铜羊,原产于成都平原及附近丘陵地区,是我国优良肉用地方山羊品种[1, 2]。成都麻羊具有生长发育快、体格较大、性早熟、繁殖能力强、屠宰率高、膻味轻、肉质嫩、板皮优良、肉皮兼用等显著特点,现有丘陵型和山地型两个生态类型[1-3]。在我国,早有引进成都麻羊改良当地山羊培育新品种的案例,如四川省有名的南江黄羊、金堂黑山羊品种[1-3]。但是,圈养规模较小、缺乏科学的管理、近亲繁殖现象等问题会导致成都麻羊的遗传变异丢失[4],引起圈养种群退化,长期会导致遗传多样性逐渐丧失,一些特有的重要基因资源会在培育中消失殆尽,同时会造成个体适应能力变弱,抗病力差,死亡率增加等[5],长期下来会影响圈养成都麻羊种群的健康发展。畜禽遗传资源本质上是基因资源,保护畜禽遗传资源就是保护基因的多样性[6]。因此,成都麻羊作为我国山羊品种的一个宝贵基因库,维持其种群遗传多样性,最大限度地降低遗传损失,保证其种群遗传健康,对其种群种质资源的良性发展和种群的遗传管理都具有重要意义。

      微卫星DNA(microsatellite DNA),是以少数几个核苷酸为基本单位进行多次串联重复的DNA序列,因而也被称为简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)或短串联重复序列(short tandem repeat,STR)[6-9]。相比其他的分子标记技术,微卫星DNA标记优点突出,如呈现共显性遗传、高度多态性等,是目前最为准确、先进的遗传标记系统之一,是种群遗传结构研究和多样性评估最常用的工具[5, 7, 10-14]。在山羊、绵羊中,利用微卫星DNA标记测定遗传多样性已有较多相关研究[9, 11, 15-21]

      鉴于此,为了加强成都麻羊资源的保护和利用,实现优质地方山羊品种种质资源的良性开发,满足市场对成都麻羊的发展需求,借助微卫星DNA作为遗传标记,对成都麻羊圈养种群进行遗传多样性现状调查,以期为该资源群体的遗传背景研究提供分子理论依据,同时对合理利用成都麻羊资源和可持续发展也具有重要意义。

      • 本研究以成都西岭雪农业开发有限公司(四川省成都市大邑县)饲养的成都麻羊为研究对象,共随机挑选268只个体采集血液样品,其中雄性个体18只,雌性个体250只。对每只成都麻羊个体进行颈静脉采血5 mL,随后用EDTA抗凝混匀,置于冰盒中带回实验室,−20 ℃保存。

      • 本研究采用Tianamp基因组DNA提取试剂盒提取DNA,提取步骤参照使用说明书执行。将提取得到的DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,并将其保存于−20 ℃冰箱。

        参考已发表文献[7, 9, 10, 16, 17, 20, 21],共选46对多态性微卫星引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过预实验筛选,有9对引物(见表1)能较稳定地扩增得到多态性较高的微卫星位点。PCR扩增体系(20 uL):DNA模板(浓度25 ng/uL)2 uL,正向引物(浓度10 umol/ul)0.5 uL,反向引物(浓度10 umol/ul)0.5 uL,Mix溶液10 uL,灭菌双蒸水7 uL。PCR扩增条件:首先95 ℃预变性持续15 min;之后94 ℃变性持续30 s,相应退火温度退火持续30 s,72 ℃延伸持续30 s,并设置30个循环;最后72 ℃终止延伸持续10 min。每次扩增过程中均设定阴性对照,每个样品扩增3次。PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后拍照。

        表 1  本研究所用微卫星DNA标记

        Table 1.  Microsatellite DNA markers were used in this study

        微卫星位点引物序列(5′-3′)5′端修饰退火温度/℃
        ILSTS004F: CTTAAAATCTGTCTTTCTTCC5`6-FAM48
        R:TAGTGTGTATTGGTTTCTCC
        INRA063F: ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC5`HEX52
        R:AAACCACAGAAATGCTTGGAAG
        OarFCB011F: GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC5`6-FAM54
        R:GGCCTGAACTCACAAGTTGATATATCTATCAC
        ILSTS030F: CTGCAGTTCTGCATATGTGG5`HEX54
        R:CTTAGACAACAGGGGTTTGG
        SR-CRSP-1F: TGCAAGAAGTTTTTCCAGAGC5`HEX54
        R:GTACCCTGGTTTCACAAAAGG
        SR-CRSP-5F: GGACTCTACCAACTGAGCTACAAG5`6-FAM54
        R:TTATGAAATGAAGCTAAAGCAATGC
        ILSTS033F: TATTAGAGGATGGATGCTAAACT5`HEX52
        R:CTGCAAATAAGAAAACTGAATAAA
        OarFCB48F: GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC5`HEX54
        R:GACTCTAGAGGTACGCAAAGAACCAG
        McM038F: TGGTGAATGGTGCTCTCATACCAG5`HEX54
        R:CAGCCAGCAGCCTCTAAAGGAC
      • 使用GeneMarker V2.2.0(Demo)软件,根据DNA片段大小范围和峰形质量确认等位基因。3个重复试验分型一致的结果直接录入数据库,若结果有差异,则需要重新跑PCR甚至重新提取DNA。利用 Excel 2007软件整理所有样品对应微卫星位点的等位基因型数据。

      • 利用Micro-Checker[22]检验每个位点是否存在无效等位基因或等位基因缺失等情况。利用Genepop on the Web[23]和GenAlEx[24]软件,对每个微卫星位点是否偏离哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)和是否存在连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)进行分析。哈迪-温伯格平衡检测中,若P>0.05,则符合哈代-温伯格平衡,说明这个群体是随机交配群体;若P<0.05,则呈显著偏离哈代-温伯格平衡状态;若P<0.01,则呈极显著偏离哈代-温伯格平衡状态。利用Cervus、GenAlEx、Excel Microsatellite Toolkit统计各个微卫星标记位点的等位基因数(k)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity,He)和多态信息含量(Polymorphism information content,PIC)[24, 25]。当PIC<0.25、0.25<PIC<0.5和PIC>0.5时,分别表示该座位为低度、中度和高度多态位点,其中高度多态位点能够提供大量的遗传信息,中度多态位点可以提供较为合理的信息[10, 11, 13, 20, 21, 26]

      • 本研究筛选得到的9对多态性微卫星位点中,高度多态标记位点有5对(PIC>0.5),可提供大量的遗传信息,中度多态标记位点有3对(0.25<PIC<0.5),能够提供较为合理的信息,低度多态标记位点仅1对(PIC<0.25),为SR-CRSP-1,可提供的信息量较差(见表2)。9个微卫星标记位点的等位基因数范围是3~7,平均值是4.89;其中,等位基因数是4及以上的微卫星位点有7个,占多态性微卫星位点总数的77.8%;等位基因数在5~7之间的微卫星位点有6个,占多态性微卫星位点总数的66.7%;仅有2个微卫星位点的等位基因数是3个(见表2)。观察杂合度的变异范围是0.250~0.839,平均值是0.547;期望杂合度的变异范围是0.226~0.766,平均值是0.539(见表2)。多态信息含量的变异范围是0.226~0.766,平均值是0.515(见表2)。

        依据哈代-温伯格平衡检测中的P值,9个微卫星标记位点中有7个标记位点符合哈代-温伯格平衡,占77.8%;另外2个标记位点(INRA063和SR-CRSP-5)显著偏离哈代-温伯格平衡,占22.2%。

        依据连锁不平衡检测结果,9个微卫星标记位点之间均不存在连锁不平衡现象(P>0.001),表明所选用的微卫星标记位点是相互独立的遗传标记系统。

      • 排除SR-CRSP-1外之后,使用剩余的8个微卫星标记位点对圈养成都麻羊种群进行遗传多样性分析,共有60个等位基因被成功检测,各标记位点的等位基因数介于5~11之间,平均值为7.5;各标记位点的平均有效等位基因数为2.36个;各个位点私有等位基因检测并未发现其存在;观察杂合度的变异范围是0.413~0.770,平均值是0.577;期望杂合度的变异范围是0.493~0.777,平均值是0.634;多态信息含量的变异范围是0.432~0.743,平均值是0.580(见表3)。

        表 2  9个微卫星标记位点多态性检测结果

        Table 2.  Polymorphism detection results of 9 microsatellite markers

        微卫星位点kNHoHePICF(Null)
        ILSTS0045310.4520.4350.404−0.0615
        INRA0635310.5160.6540.5980.1032
        OarFCB0114320.5940.6290.551−0.0297
        ILSTS0306320.8130.6850.633−0.0991
        SR-CRSP-13320.2500.2260.226−0.0608
        SR-CRSP-57320.5940.5910.591−0.0116
        ILSTS0335290.4140.4590.4590.0122
        OarFCB486310.8390.7660.766−0.0582
        McM0383310.4520.4100.410−0.0721
          注:k表示等位基因数,N表示DNA样品量,Ho表示观察杂合度,He表示期望杂合度,PIC表示多态信息含量

        表 3  圈养成都麻羊种群遗传多样性情况

        Table 3.  Genetic diversity of captive Chengdu gray goat population

        微卫星标记kNHoHePICHWEF(Null)
        ILSTS004112600.5650.6100.585NS0.0367
        INRA06352540.5940.6750.622NS0.0579
        OarFCB01182600.5310.6350.565NS0.0900
        ILSTS03072670.7040.6960.656NS−0.0110
        SR-CRSP-582610.5980.6140.567NS0.0063
        ILSTS03372620.4430.4910.468NS0.0500
        OarFCB4892560.7700.7770.743NS0.0037
        McM03852640.4130.4930.432NS0.0815
          注:k表示等位基因数,N表示DNA样品量,Ho表示观察杂合度,He表示期望杂合度,PIC表示多态信息含量,HWE表示哈代-温伯格平衡
      • 在8个微卫星标记位点中,等位基因较多的前4个是:ILSTS004,共检测到11个等位基因,大小分布在111~131 bp,频率范围为0.0038~0.6000;OarFCB48,共检测到9个等位基因,大小分布在148~168 bp,频率范围为0.0039~0.3262;SR-CRSP-5,共检测到8个等位基因,大小分布在168~186 bp,频率范围为0.0077~0.5613;OarFCB011,共检测到8个等位基因,大小分布在133~157 bp,频率范围为0.0019~0.4615(见图1)。

        图  1  微卫星标记位点的等位基因分布

        Figure 1.  Allele frequency of microsatellite markers

        在8个微卫星标记位点中,等位基因较少的4个位点是:ILSTS033,共检测到7个等位基因,大小分布在148~166 bp,频率范围为0.0057~0.6985;ILSTS030,共检测到7个等位基因,大小分布在161~175 bp,频率范围为0.0019~0.4775;McM038,共检测到5个等位基因,大小分布在123~139 bp,频率范围为0.0038~0.6629;INRA063,共检测到5个等位基因,大小分布在160~168 bp,频率范围为0.0138~0.4685(见图1)。

      • 遗传多样性是一个物种适应环境变化所必需的条件[7]。种群内的遗传多样性反映了一个物种的进化潜力,是其遗传特征进化的基础[26]。一个物种的遗传变异越丰富,其对自然选择和环境变化的适应能力就越强[6, 9, 12, 27]。遗传多样性通常用等位基因多样性、多态性、平均杂合度等指标来描述[6, 12, 16, 19]

        在同一微卫星位点中,随着核心重复序列重复次数的变化,该位点的片段长度也会发生变化,继而形成等位基因[11, 17];等位基因是形成群体遗传多态性的基础,等位基因数越多,遗传多态性越丰富[17]。评价位点多态性高低的指标是多态信息含量[17]。本研究从9个微卫星位点中筛选到5个高度多态的位点、3个中度多态性的位点、1个低度多态性的位点,因此仅有前8个可作为有效的分子标记进行群体遗传多样性分析。在后续的分析中我们使用了这8个中高度多态的微卫星位点分析了268份成都麻羊样品,最终在这8个位点中一共检测到的等位基因数为60个,平均等位基因数为7.5,与其他绵羊种群相比,要高于甘肃高山细尾羊、滩羊、藏羊等[7],低于山东省的小尾寒羊、大尾寒羊、山地绵羊、洼地绵羊等[28],与四川省布拖黑绵羊种群基本持平[10],但与其他山羊种群相比,要高于山西黎城大青羊、山西吕梁黑山羊、宁夏中卫山羊、贵州白山羊、云南威信白山羊等[11, 16, 19],低于湖南湘东黑山羊、重庆川东白山羊、云南云岭山羊、河南黄淮山羊等[11]。不过,这并不能排除种群大小和所用微卫星位点数不同而造成的差异。有研究表明,如果样本量太少,会导致一些频率较低的等位基因无法被检测到,进而对试验结果的准确性造成影响[9]。本研究使用了8个微卫星位点分析了268份成都麻羊样品,微卫星位点数量属于平均水平,种群样本量较大,而个别其他研究的样本量最少仅有20余份[11, 17],微卫星位点数量最少仅有5个[7, 17]。以同一微卫星位点而言,种群样本量越大,其观察到的等位基因数往往越多,以微卫星位点ILSTS004、OarFCB011和ILSTS030为例,本研究中观察到的等位基因数目分别为11、8和7,而在刘成建的研究中(涉及20个样本量)仅为5和4[17]。此外,在本项研究中,成都麻羊群体中8个微卫星位点的多态信息含量的变异范围是0.432~0.743,平均多态信息含量0.580,与刘成建的研究结果(0.604)基本一致[17],表明了成都麻羊群体具有较丰富的遗传多样性。

        基因杂合度,它反映了群体在几个位点的遗传变异情况,是被检测的遗传标记的多态性的度量参数[10, 17]。若某个群体的基因杂合度大于0.5,则意味着该群体还未受到高强度的选择压力,其遗传多样性比较丰富[10, 17]。在本项研究中,成都麻羊群体的平均观察杂合度和平均期望杂合度分别为0.577和0.634,表明该群体有较丰富的遗传多样性,该结果与前述多态性的分析结果相一致。另外,刘若余等人基于线粒体D-loop序列调查了中国9个山羊品种的遗传多样性,其中成都麻羊的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为1.0000±0.0243和0.017956±0.004410,同样表明其有着丰富的遗传多样性[29]

        有效等位基因数也可以反应群体的遗传变异大小,在数值上等于基因纯合度的倒数[9, 16, 17]。若有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数,则说明等位基因在群体中分布越均匀[9, 16, 17, 21]。本研究中,成都麻羊群体平均有效等位基因数(2.36)低于实际观测到的等位基因数(7.5),说明有些等位基因频率相对较高,而另一些相对较低,等位基因在群体中分布得并不均匀,图1也具体地展示了这一现象,究其原因应该是圈养种群频繁人工选择和一定的近亲繁殖造成的。研究同时发现,成都麻羊群体的观察杂合度和期望杂合度之间差异很小,仅为0.057,这说明就目前而言,成都麻羊群体受外来选择压力和近交繁殖等因素的影响还比较小,群体依旧处于遗传平衡的状态

        种群遗传学管理的目的是保持种群的遗传多样性,避免近亲繁殖[30]。如果对一个封闭的小种群不采取任何人工干预措施,最终必将造成近亲交配,进而引发近交衰退。鉴于成都麻羊种群的遗传多样性还比较高,受近亲繁殖等因素影响还较小,具有较高的保种潜力,建议开展全面采样,借助微卫星DNA标记技术,完善个体信息档案,构建起具有完整代表性的成都麻羊种群遗传谱系关系。

    参考文献 (30)

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