草珊瑚(Sarcandra glabra Nakai)，俗称满山香、观音茶、接骨木、九节茶等，是金栗兰科多年生常绿亚灌木，主要分布于我国长江以南各省区及东南亚等地^[1]。草珊瑚是常用中药材，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络之功效，临床上常用于血热发斑发疹、风湿痹痛、跌打损伤等^[2]。同时其形态秀丽、四季馨香，具有极高的食用及观赏价值，草珊瑚适应性强，既可制作清雅小巧的盆栽，置于室内观赏，也可用于园林、庭院的绿化点缀^[3]。

全国草珊瑚干品药材原料的需求量每年达万吨以上^[4]，随着草珊瑚需求的日益增加和野生资源减少，近年来在江西、福建、广西等地开始进行人工林下栽培^[5]。种苗是草珊瑚扩大种植规模的关键。目前，草珊瑚主要采用播种、分株、扦插等方式进行栽培繁殖。种子苗存在变异，幼苗规格大小不一，而且还受育种时间、育种环境和材料多少的限制；硬枝扦插、分株繁殖受育苗时间、育种环境和材料多少的限制；而组织培养则不受时间和空间的限制，繁殖速度快，一年四季都可以批量生产优质健康、遗传特性一致的草珊瑚苗木^[6-8]。目前，草珊瑚外植体消毒、接种与初代培养、继带与生根培养、炼苗驯化等方面已取得很多研究成果^[9-11]，一般采用MS为基本培养基，本研究比较了MS、1/2MS、B5、ER培养基的诱导效果，并对草珊瑚组织培养各个环节进行系统研究，建立草珊瑚组培快繁技术体系，可为草珊瑚的组培工厂化育苗和产业化发展利用提供技术服务。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

试验材料选自成都市农林科学院林业研究所科研种植园区引种的长势良好、健壮、无病虫害的草珊瑚优良单株，在不同时期剪取带腋芽的茎段作为供试材料。

1.2   试验方法

1.2.1   外植体的处理

在4—5月、7—8月、9—10月分别取带腋芽的半木质化枝条作为外植体，预处理后置于超净工作台上。将外植体分成顶芽和茎段分别装入无菌瓶中，顶芽用0.1%氯化汞浸泡5～6 min，茎段用75%酒精处理30秒后用0.1%氯化汞浸泡8～10 min，无菌水冲洗6遍，用无菌滤纸吸干水分，剪成带1～2个腋芽的茎段接种于准备好的培养基上，25 ℃暗培养。接种后5～7 d观察并记录感染情况，30 d后统计感染率与死亡率，各处理重复3次。

感染率（%）=感染外植体总数/接种外植体总数×100

死亡率（%）=死亡外植体总数/接种外植体总数×100

1.2.2   诱导培养

将无菌外植体分别接种于MS、1/2MS、B5、ER基本培养基中，每种培养基设置两种激素配比，分别为0.4 mg·L⁻¹ 6-BA+0.2 mg·L⁻¹ NAA和0.8 mg·L⁻¹ 6-BA+0.3 mg·L⁻¹ NAA先期暗培养，待腋芽萌发后转置400～800 lx、25 ℃的条件下培养，45 d后观察并统计其结果，各处理重复3次。

1.2.3   增殖培养

以改良的B5为基本培养基，分别以6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L⁻¹），NAA（0.2、0.5 mg·L⁻¹），AC（0、1.0 g·L⁻¹）作为激素配比，蔗糖为3%，共设置18个处理。接种后于25 ℃进行暗培养，培养20 d左右待新芽长出，在400～800 lx下培养，60 d后观察其生长情况并统计增殖系数，每处理重复3次。

增殖系数=单个茎段继代一次后增殖总数/单个茎段总数

1.2.4   生根培养

以1/2B5为基本培养基，添加激素NAA（0.1、0.2 mg·L⁻¹），IBA(0.1、0.3、0.5 mg·L⁻¹），AC（0、1.0 g·L⁻¹）多因子不同配比组合作为生根试验培养基。25 ℃左右，暗培养15 d左右，待其大部分小苗生根后放到光照强度为500～1 000 lx培养，60 d后在移栽洗苗时统计生根率和苗高，重复3次。

生根率（%）=生根植株总数/接种植株总数×100

1.2.5   炼苗及移栽

将瓶苗从组培室移到自然环境中炼苗7 d后，洗去培养基，用0.1%多菌灵浸泡15～30分钟后进行移栽，移栽基质为腐殖土、珍珠岩、椰糠、泥土的不同配比组合。每种基质移栽50株草珊瑚苗，移栽后用薄膜覆盖，移栽后3 d喷洒1次杀菌剂后，以后每周用广谱杀菌剂（70%多菌灵、70%百菌清、70%甲基托布津1 000倍液交替使用）喷施，90 d后观察其生长情况并统计成活率。每处理重复3次。

成活率（%）=移栽成活组培苗总数/移栽组培苗总数×100

2.   结果与分析

2.1   无菌株的建立

试验结果表明，顶芽+嫩茎作为外植体接种后感染率低，但死亡率极高，半木质化基部茎段感染率较高，但死亡率低；4—5月取样的外植体感染率和死亡率最低，7—10月取样接种的外植体感染率和死亡率最高，因此，建立无菌株的外植体应选用4—5月木质化程度较高且较粗壮的半木质化枝条的基部茎段。

表  1  草珊瑚不同取样时间和接种部位感染率与死亡率一览表

Table  1.  Infection rate and mortality rate at different sampling times and inoculation sites of Sarcandra glabra

取样时间 Sampling time	接种部位 Inoculation sites	感染率/% Infection rate	死亡率/% Mortality rate
4—5月	顶芽+嫩茎	11.70	91.20
	基部茎段	37.10	7.10
7—8月	顶芽+嫩茎	35.30	100.00
	基部茎段	92.30	11.70
9—10月	顶芽+嫩茎	26.00	92.50
	基部茎段	66.70	10.00

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2.2   诱导培养

将无菌株接种于不同激素配比的4种基本培养基中进行诱芽培养，结果表明4种培养基均能诱导草珊瑚出芽。1/2MS培养基诱导的芽弱，叶色淡，且叶柄与茎段连接处容易产生白色愈伤从而使叶柄断裂；MS和ER培养基中的茎段诱芽率较低，叶柄处容易变黑导致整株变黑死亡；B5培养基对草珊瑚诱芽效果较好。因此，草珊瑚最佳诱芽培养基为B5+0.8 mg·L⁻¹ 6-BA+0.3 mg·L⁻¹ NAA。

表  2  四种基本培养基诱导成芽结果统计

Table  2.  Statistics results on bud formation induced by four basic culture medium

处理 号No.	基本培养 基Basic medium	6-BA mg·L−1	NAA mg·L−1	诱芽率/% Bud formation	生长状况 Growth status
1组	MS	0.4	0.3	78.00	芽长势慢，易变黑死亡
2组	MS	0.8	0.3	80.00	易变黑死亡
3组	1/2MS	0.4	0.3	72.00	单芽，叶色偏黄
4组	1/2MS	0.8	0.3	74.00	长势差，叶色偏黄
5组	B5	0.4	0.3	84.00	芽长势慢
6组	B5	0.8	0.3	83.00	芽壮，叶绿长势好，
7组	ER	0.4	0.3	74.00	芽小易变黑死亡
8组	ER	0.8	0.3	78.00	芽小易变黑死亡

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2.3   增殖培养

以不同激素配比的改良B5诱导无菌芽进行增殖培养，由表3和图1可以看出，草珊瑚在没加入活性炭（AC）的培养基中，芽的增殖系数随6-BA的增加而增加，而芽的高度在6-BA小于4 mg·L⁻¹时变化不大，当浓度大于4 mg·L⁻¹时，高度则随6-BA浓度的增大而变矮，植株叶子泛黄变小且较脆，茎节变短粗，植株不长高。由表3和图2可以看出，草珊瑚在加入1 mg·L⁻¹ AC的培养基中，芽的增殖系数和高度随6-BA的增加变化不大，与不加AC相比，能明显增加植株的高度，而且植株容易生根，适合生根之前的壮苗培养。综上所述，AC=0 mg·L⁻¹，B5+3.0 mg·L⁻¹ BA+0.5 mg·L⁻¹ NAA培养基对芽的增殖系数和株高等综合表现最好，是草珊瑚增殖继代最佳培养基配方。

图  1  不同增殖培养基诱导草珊瑚增殖系数

Figure  1.  Proliferation coefficient of sarcandra glabra induced by different culture medium

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图  2  不同增殖培养基诱导草珊瑚株高

Figure  2.  Plant height of Sarcandra glabra induced by different culture medium

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表  3  草珊瑚增殖试验结果统计

Table  3.  Statistics results on proliferation test of sarcandra glabra

编号 No.	6-BA mg·L−1	NAA mg·L−1	AC=0 g·L−1				AC=1 g·L−1
			平均增殖系数 Proliferation coefficient	平均芽高/cm Bud height/cm	生长状况 Growth status		平均增殖系数 Proliferation coefficient	平均芽高/cm Bud height/cm	生长状况 Growth status
1组	1.0	0.2	3.09	1.67	茎粗短		2.18	2.98	芽少苗高生根现象
2组	1.0	0.5	3.27	1.98	茎粗长势好		2.09	3.17	芽少苗高生根现象
3组	2.0	0.2	4.55	2.12	叶小茎粗		1.91	3.27	芽少苗高生根现象
4组	2.0	0.5	4.27	2.95	叶较大茎粗		2.09	2.75	芽少苗高生根现象
5组	3.0	0.2	6.55	2.72	叶较大茎粗		2.46	2.90	芽少苗高生根现象
6组	3.0	0.5	6.82	2.98	长势好		2.09	3.02	芽少苗高生根现象
7组	4.0	0.2	7.46	0.74	叶小、芽成簇无长势		2.36	2.73	芽少有生根现象
8组	4.0	0.5	7.27	0.79	叶小茎粗无长势		2.27	2.70	芽少有生根现象
9组	5.0	0.5	10.64	0.68	叶小叶黄茎粗芽成簇		2.18	2.63	芽少有生根现象

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2.4   生根培养

从表4可以看出，各因数水平组合间的生根情况无较大差异，几乎无侧根和须根，叶色油绿。随着NAA、IBA浓度的增加生根率增加，茎变粗，叶变大。综合比较，3组培养基诱导生根率达到100%，平均生根数大于6.5条，生根质量好，生根整齐，根茎较粗，叶较大，所以1/2B5+0.1 mg·L⁻¹ NAA+0.8 mg·L⁻¹ IBA培养基为草珊瑚生根培养最佳培养基。

表  4  草珊瑚生根培养试验结果统计

Table  4.  Statistics results of root culture test of Sarcandra glabra

编号 No.	基本培养基 Basic medium	NAA mg·L−1	IBA mg·L−1	生根率/% Rooting rate /%	平均生根数/条 Rooting number	平均株高/cm Plant height/cm	生长状况 Growth status
1组	1/2B5	0.1	0.4	95.50	4.56	3.83	茎粗，叶大
2组	1/2B5	0.1	0.6	98.00	5.16	3.72	茎较粗，叶大
3组	1/2B5	0.1	0.8	100.00	6.51	3.51	茎较粗壮，根较粗，叶大
4组	1/2B5	0.2	0.4	98.50	4.40	3.22	茎粗壮，叶较大
5组	1/2B5	0.2	0.6	100.00	3.88	3.92	茎粗，叶较大
6组	1/2B5	0.2	0.8	100.00	4.98	3.93	茎较壮，根较粗、叶较大
7组	1/2B5	0	0.8	92.50	3.48	4.82	茎细、根细长、叶小
8组	1/2B5	0	1.0	94.00	3.07	4.58	茎细、根细长、叶小

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2.5   炼苗移栽

从表5可以看出草珊瑚组培苗在4组基质中炼苗移栽成活率最高，成活率达94%，生长状况好，叶大，苗子长势壮。所以4组腐殖土∶椰糠∶珍珠岩∶泥土=5∶2∶1∶2组合基质为草珊瑚移栽最佳基质。

表  5  草珊瑚炼苗移栽试验结果统计

Table  5.  Statistics results on acclimatization and transplant of Sarcandra glabra

编号 No.	腐殖土 humus soil	椰糠 Coconut bran	珍珠岩 Perlite	泥土 Soil	成活率 survival ratio/%	生长情况 Growth status
1组	9	0	1	0	78.33	苗弱，叶色偏黄
2组	8	0	1	1	85.67	苗较壮，叶色偏绿，
3组	7	1	1	1	92.67	苗较壮，叶色绿，
4组	5	2	1	2	94.00	苗壮，叶色绿、长势快
5组	5	3	1	1	88.33	苗较壮，叶小，叶绿
6组	6	0	1	3	81.67	苗较壮，叶小，叶绿
7组	10	0	0	0	80.67	苗弱，叶小，叶色偏黄

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图  3  草珊瑚组织培养过程

注：A.诱芽培养；B.增殖培养；C.生根培养；D.炼苗移栽

Figure  3.  Tissue culture process of Sarcandra glabra

Note: A. Induced bud formation; B. Proliferation culture; C. Rooting culture; D. Acclimatization and transplanting

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3.   结论与讨论

（1）草珊瑚无菌株建立的外植体最佳时间为4—5月，最佳外植体是从基部长出的健壮半木质化枝条的基部茎段；

（2）草珊瑚增殖培养要求大量元素的量不能太高，B5是草珊瑚组织培养的最适基本培养基。AC=0 mg·L⁻¹，B5+3.0 mg·L⁻¹ 6-BA+0.5 mg·L⁻¹ NAA是草珊瑚增殖继代最佳培养基配方。

（3）草珊瑚继代周期较长约2～3个月左右，培养最佳温度为20～25 ℃，最佳光照强度为400～800 LX，pH值在5.4～6.0之间。激素6-BA在芽诱导和增殖中均起关键性作用，随着6-BA浓度的增加增殖系数随之增加，但当浓度增加到大于3.0 mg·L⁻¹时芽矮成簇不抽高，叶色黄，叶小向下反卷；生长素NAA在各个培养阶段中都起重要作用，在增殖培养过程中NAA与6-BA比值决定了草珊瑚长势，苗子的抽长和木质化程度随之增加而加大；加入活性炭的培养基诱导草珊瑚几乎无新芽产生，但能促进组培苗的长高，有利于成簇的芽的抽长，新长出来的叶色为深绿色，富有光泽。

（4）草珊瑚比较容易生根，在继代培养基中加入活性炭的部分幼苗也会生根。根的着生部位主要在叶柄与茎段连接处，木质化比较高的草珊瑚苗生根早，越靠近基部的茎节生根较早且根数多，几乎无须根。