Construction of Core Collection of Phoebe zhennan Based on SSR Molecular Markers

2012年，在四川、重庆、湖南、湖北和贵州省等楠木产区根据树高、胸径和环境适应性选择优树102株，基本涵盖了楠木天然分布区，分单株采集优树种子，沙藏；2013年春季分家系育苗；2014年在泸州市玉蟾山国家林草长期科研基地建立楠木种质资源基因库（105.387529°E, 29.137715°N, 海拔553 m）。2022年6月，对102个家系采集新鲜嫩叶，将其放入硅胶中保存，带回实验室置于−80℃冰箱中保存备用。

本研究采用改良CTAB法快速提取楠木基因组DNA。选用14对条带清晰、多态性强的SSR引物进行PCR扩增（见表1），SSR引物由生工生物（上海）股份有限公司合成荧光引物，扩增产物经Fragment Analyzer全自动毛细管电泳分析仪进行检测^[13]。

（1）M策略：以核心种质中标记位点最大化为标准的核心种质构建方法^[14]。通过Core Finder软件以等位基因最大化为原则抽取核心种质^[15]。

（2）随机取样法：依据张春雨等^[16]随机取样策略，以10%、20%、40%和50%为取样比例，分别构建核心种质。

（3）以核心种质保留等位基因或遗传多样性最大化分别构建核心种质，抽样比例为10%、20%、40%和50%，借助PowerMarker version 3.25软件进行核心种质的抽取^[17]。

使用Genemarker 2.2.0软件分析毛细管电泳数据。Cervus 3.0.7软件计算多态信息含量（PIC）^[18]。利用GeneAlEx 6.5软件^[19]计算等位基因数、有效等位基因数、期望杂合度、观测杂合度及Shannon’s信息指数，用这些指标来评价核心种质、原有种质与保留种质的遗传多样性，并通过t检验对核心种质与原有种质各遗传多样性指标进行差异显著性分析^[2]。同时，运用主坐标分析法对构建的核心种质进行确认。最后，将SSR-PCR产物毛细管电泳谱带转化为数字指纹图谱，以此构建楠木核心种质的分子身份信息。

利用14对SSR引物对102份楠木种质资源进行遗传多样性分析（见表2）。结果显示，14对SSR引物共检测到166个等位基因，每对SSR引物检测到等位基因数的范围在2（PZmf07、CL20730Contig1、PZmf05和PZmf02）~37（MN-g3）之间，平均为12。有效等位基因数平均为4.875，各引物检测到的有效等位基因数在1.021（PZmf02）~3.125（MN-g3）之间。期望杂合度与观测杂合度分别在0.117（PZmf07）~0.943（MN-g3）和0.000（PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf02）~0.978（MN-g3）之间，平均分别为0.561和0.373。Shannon’s信息指数最高的为引物MN-g3（3.125），其次为引物MN-g5（3.029），最低为引物PZmf02（0.057），楠木种质资源平均Shannon’s信息指数为1.297。以上结果表明楠木种质资源具有较为丰富的遗传多样性。

随取样比例的增加，不同取样策略构建的候选核心种质等位基因数及其保留率呈逐渐上升的趋势（见表3）。在取样比例较低时，各遗传多样性参数值和保留率均处于较低水平。如随机取样和遗传多样性最大化策略在取样比例低于20%时，其等位基因数和有效等位基因数的保留率均低于60%，表现出明显的等位基因缺失。当取样比例为50%时，虽然随机取样、等位基因最大化和遗传多样性最大化法构建的候选核心种质Shannon’s信息指数均略高于原有种质，但其余遗传多样性参数，如观测杂合度、期望杂合度明显低于原有种质。而M策略以58.8%的取样比例构建的核心种质有效等位基因数、Shannon’s信息指数、观测杂合度以及期望杂合度均明显高于原有种质，等位基因数保留率100%。不同取样策略构建的候选核心种质与原有种质遗传参数t检验结果显示，Shannon’s信息指数和期望杂合度在各种质间无显著差异，候选核心种质与原有种质存在显著差异的遗传参数主要集中在等位基因数、有效等位基因数和观测杂合度。10%取样比例时，随机取样、等位基因最大化和遗传多样性最大化法构建的候选核心种质等位基因数和有效等位基因数均显著低于原有种质。M策略构建的核心种质各遗传参数与原有种质并无显著差异。根据5个遗传参数的综合考虑，选择M策略抽取的60份（58.8%）种质资源构建的楠木和新种指能够以较小的种质份数最大程度地代表整个楠木种质资源地遗传多样性。利用M策略构建的楠木核心种质中包含四川36份（55.4%）、湖北5份（45.5%）、湖南11份（64.7%）、贵州5份（83.3%）和重庆3份（100.0%）共计60份种质材料。

M策略构建的楠木核心种质保留了原有种质58.8%的材料，等位基因数、有效等位基因数、Shannon’s信息指数、观测杂合度和期望杂合度的保留率分别为100.0%、106.9%、105.5%和102.7%（见表4）。t检验结果也表明，利用M策略构建的楠木核心种质和原有种质的遗传多样性参数间差异不显著。由此，认为本研究利用M策略构建的核心种质具有很高的代表性。采用主坐标分析法（PCoA）对构建的核心种质进行比较分析，以进一步确定其代表性。结果显示，楠木核心种质在整个种质资源的主坐标图内均匀分布，表明M策略构建的楠木核心种质具有很好的代表性（见图1）。

Figure 1.  Principal coordinates lots of core collection and original collection

利用14对SSR引物扩增的全部多态性谱带构建了60份楠木核心种质的分子身份信息（见表5）。每份核心种质材料都有其唯一的分子身份信息，可以通过其专一的分子身份信息将60份核心种质材料相互区分鉴别出来。

种质资源收集和保存对于保存物种遗传多样性和育种利用具有重要意义，是育种循环的必不可少的组成部分。所以，采用合适的技术方法构建核心种质，对于优异种质资源的挖掘利用，提高种质资源的利用价值和效率具有重要的指导意义^[3]。而关于林木核心种质的构建方法，前人已有一些研究。Yang等^[6]认为核心种质的数量应根据种质资源的总数及其遗传变异的丰富程度而定。如果种质资源数较少，则核心种质取样的比例可以相对大一些；如种质资源总数很大，则核心种质取样比例可以小一些^[5]。例如，Yang等^[6]在304份马尾松二代育种群体中以34.2%的比例抽取104份种质构建了马尾松二代育种核心种质。杨汉波等^[2]以15.3%的比例从754份木荷种质资源中抽取115份种质组成木荷核心种质。本研究利用M策略以58.8%的抽样比例从102份楠木种质资源中抽取60份种质组建核心种质，能够最大程度地代表原有种质的遗传多样性。以上结果均反映出供试种质资源数量对核心种质抽样比例有明显影响，分析其原因可能为：（1）相对较少的种质资源数，暗示种质资源选择时的强度较大，中选并保存的优异种质资源具有丰富的遗传变异，导致在构建核心种质时需要抽取更多的种质数以保证核心种质的代表性；（2）核心种质抽样方法的不同也可能造成最终核心种质抽样比例存在差异。因此，对于不同种质资源总数的树木核心种质抽样方法的选择对正确构建核心种质的关键。

目前，主要通过表型数据、遗传标记数据或表型与分子标记相结合的方式来构建核心种质^[20]。在许多作物中，通常是应用形态学数据对原始群体进行压缩，建立基于形态学数据的初级核心种质，然后再利用分子数据压缩原始群体，建立基于分子数据的初级核心种质，最后将二者进行综合，构建最终的核心种质^[21-22]。但这在树体高大、表型变异丰富的林木而言，要得到可靠的表型数据需要较长的年限^[23]。DNA分子标记不会或极少受到环境的影响，较形态学标记更适用于构建核心种质，且优势明显^[24-25]。已有相当数量的林木树种利用分子标记技术成功构建了核心种质，反映出DNA标记技术在林木核心种质构建中的高效性和准确性。例如，Liang等^[26]利用SSR标记从苹果种质中以13.2%的抽样比例构建了苹果核心种质。刘勇等^[27]根据678个SSR和AFLP分子标记聚类结果，采用逐级压缩法选择、构建了包含25份样本的柚类核心种质。曾宪君等^[28]利用SSR分子遗传多样性以30.2%的抽样比例构建了欧洲黑杨核心种质。本研究中，基于等位基因和遗传多样性取样策略构建的楠木核心种质等位基因数等遗传多样性参数保留率明显高于随机取样策略。这与刘娟等^[29]、杨汉波等^[2]对杏和木荷核心种质构建的结果相一致，均证明基于等位基因和遗传多样性优先的取样策略优于随机取样策略。本研究对不同取样策略构建的候选核心种质遗传多样性参数利用t检验在统计学上进行验证，以验证各候选核心种质的代表性。最终确定M策略是楠木核心种质的最优取样策略，并以此构建了包含60份种质的楠木核心种质，5个省（市）的种质资源均有抽取。当然，由于本次研究的楠木种质资源总数偏少且遗传多样性丰富，导致核心种质抽取比例偏大，也从侧面反映出资源收集的欠缺，后续应当进一步强化楠木种质资源全面调查，以最大限度地收集楠木优良种质资源，扩大种质资源的数量，提高遗传多样性，以期在楠木育种循环中获得更高的遗传增益。

通过DNA指纹是目前品种资源鉴定的有效技术手段，在植物品种鉴定中得到广泛应用^[30]。如郭娟等^[31]利用61条SRAP特异性条带构建了5个杨树品种的分子指纹图谱。何旭东等^[32]优选核心EST-SSR引物组合构建杨树品种的指纹图谱，可以将33个杨树品种准确区分开来。沈敬理等（2015）采用15个SSR位点+2对SRAP标记组合的方式构建了马尾松种子园131个无性系的DNA指纹图谱，可有效区分种子园各无性系。以上研究均表明，利用分子标记技术可实现种质或品种的高效、精准鉴别。本研究利用全部14对SSR引物扩增的多态性条带构建了60份楠木核心种质的分子身份信息，可以实现每份核心种质的准确鉴定。考虑到引物数量在种质鉴定中重要作用，在今后的工作中，可适当增加标记数量以形成更加精准的分子身份信息，以提高种质鉴定的准确性，为辅助杂交亲本选配和再选育提供参考。