Study on Callus Induction and Differentiation of Gerbera delavayi Leaves

试验材料来源于四川省草原科学研究院收集的原产于德昌南山傈僳族乡的火草资源，春季从越冬成功的一年生实生苗中选择生长旺盛、无病虫害的优良植株，剪取叶片带回实验室备用（见图1A）。

Figure 1.  Leaves and typical callus morphology of Gerbera delavayi.
A: close-up of Gerbera delavayis leaves; B: Callus morphology in Y1 medium; C: Callus morphology in Y3 medium; D: Callus morphology in Y5 medium; E: Callus morphology in Y9 medium.

用洗洁精水轻揉叶片2 min以降低表面张力后，自来水下冲洗掉叶片10 min，在超净台上用75%的酒精表面消毒30 s，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞消毒处理，最后用无菌水冲洗4—5次后，将叶片切成1.5×1.5 cm，平铺于MS+30 g·L⁻¹培养基上，每瓶1个外植体。0.1%升汞消毒时间分别设5、8、11、14、17 min等5个梯度，每处理接种10瓶，重复3次。7 d后调查污染率和死亡率。

以WPM培养基作为基本培养基，将无菌叶片转移至添加不同浓度0.3、0.45和0.6 mg·L⁻¹6-苄基腺嘌呤（6-BA）和0.15、0.3和0.45 mg·L⁻¹萘乙酸（NAA）组合的诱导培养基上培养30 d。每个处理接种10瓶，每瓶1个外植体，重复3次，30 d后调查叶片愈伤组织诱导率。

愈伤组织在诱导培养基上增殖培养一代后，切去叶片，把愈伤组织切成0.5 cm左右的小块转入添加不同浓度0.6、0.75、0.9 mg·L⁻¹6-BA和0.15、0.3和0.45 mg·L⁻¹NAA组合的分化培养基中。每瓶接种3个愈伤，每处理接种5瓶，重复3次。25 d后调查叶片愈伤组织分化情况。

将分化出的不定芽的愈伤组织切成小块的带芽愈伤组织并转接到分化培养基中，25 d后统计不定芽数量，调查不定芽的状态。

将芽丛中苗高1.5 cm以上、叶片翠绿的壮苗切下，转接至添加不同浓度0.1、0.5、1.0 mg·L⁻¹IBA和0.1、0.2 mg·L⁻¹NAA组合的生根培养基中，每瓶接种6个芽苗，每处理接种5瓶，每瓶10株，重复3次。20 d后调查生根数、根长和生根率及生根苗状态。

愈伤组织诱导、分化和不定芽增殖培养基以WPM为基本培养基，培养基中均加琼脂粉6.0 g·L⁻¹，蔗糖30 g·L⁻¹。生根培养以DKW为基本培养基，培养基中均加琼脂粉6.0 g·L⁻¹，蔗糖15 g·L⁻¹。pH值5.8—6.0，培养温度(25±2)℃，光照强度2 000—3 500 LX，光照10 h/d^[11]。

当火草生根苗根长至2 cm长时，就可将组培瓶摆放到大棚内，瓶盖拧开并虚掩3—5 d^[11]，取出幼苗，流水下洗净根部培养基，将幼苗移栽到珍珠岩∶草炭=1∶1配比的基质中^[3]，栽后定期雾状喷水保湿^[4]，20 d后统计成活率。

污染率=污染叶片数/叶片总数×100%；褐化率=褐化叶片数/叶片总数×100%；存活率=无污染并无褐化的叶片数/叶片总数×100%；愈伤诱导率=形成愈伤数/接种总数；分化愈伤平均芽数=每瓶中不定芽数量/每瓶的愈伤块数；平均生根率=生根总株数/接种总株数×100%。

采用DPS16.05版对实验数据进行Tukey法单因素方差分析，百分数采用反正弦平方根转换后再进行方差分析。

火草叶片消毒表明，不同消毒处理对火草叶片平均污染率和平均褐化率有显著性影响（见表1），随着消毒时间的增加，污染率逐步下降，但褐化率逐步增加，而平均存活率表现为先上升后下降的趋势，以4号消毒处理的平均存活率最高，5号消毒处理的平均存活率稍低于4号消毒处理，但不存在显著性差异。

尽管4号消毒处理中叶片的50%的平均污染率显著高于5号消毒处理的16.67%的平均污染率，但5号消毒处理的叶片褐化率太高，其实不利于后续的培养。因此，综合来看，火草叶片外植体的0.1%升汞最佳消毒时间为4号消毒处理的14 min。

处理5的叶片污染率最低，但成活率也最低。导致死亡原因是消毒时间过长，虽然无污染，但5—7 d后叶片褐化死亡。综合污染率和死亡率得出，火草叶片外植体处理最佳时间为14 min。

同一列中不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下表同此。

火草外植体在不同愈伤组织诱导培养基中的愈伤组织诱导率差异均不显著，但不同处理间愈伤组织形态和结构差别较大（见表2）。叶片在接种到培养基上后7—10 d，与培养基接触的切口部位逐渐膨大，并长出淡黄色愈伤组织，随后颜色变成绿色、红色或褐化（见图1）。

Y1、Y4和Y7的愈伤组织诱导培养基中6-BA浓度均为0.3 mg·L⁻¹，3个培养基叶片愈伤组织形成速度慢，均在10 d时才可见膨大切口处出现颗粒状红色小颗粒愈伤，这些愈伤形成后生长停滞，培养后期容易褐化（见图1B）。Y2、Y5和Y8诱导培养基6-BA浓度为均0.45 mg·L⁻¹，当NAA浓度为0.15 mg·L⁻¹和 0.3 mg·L⁻¹时（即Y2和Y5），均能形成绿色的愈伤，但Y5愈伤生长速度更快，且有玻璃化迹象；当NAA浓度为0.45 mg·L⁻¹时，形成红绿相间的愈伤，生长快，结构稍松软（见图1C）。Y3、Y6和Y9的愈伤组织诱导培养基6-BA浓度为0.6 mg·L⁻¹，当NAA浓度为0.15 mg·L⁻¹时，形成红绿相间愈伤，结构松软半透明（见图1C）；当NAA浓度为0.3 mg·L⁻¹时，能够较快地形成结构致密，质地硬的绿色愈伤；当NAA浓度为0.45 mg·L⁻¹时，诱导率最高63.3%，而且出愈伤的速度最快，观察发现7 d愈伤直径可达0.5 cm，绿色正常愈伤结构致密，质地硬，且不易褐化（图1D）。表明低浓度6-BA不利于愈伤的诱导和生长，高浓度的6-BA对愈伤的形成有促进作用。在6-BA浓度不变时，较高浓度的NAA有利于愈伤结构的致密化，而处于低浓度NAA培养基中的愈伤组织相对松软或玻璃化，不利于后续的分化。

综上所述，WPM+0.6 mg·L⁻¹6-BA+0.45 mg·L⁻¹NAA+30 g·L⁻¹蔗糖为火草叶片愈伤组织诱导的最佳培养基。

愈伤组织在最佳诱导培养基中诱导和生长的过程中，未分化出不定芽，表明激素组合和浓度仅适合于愈伤组织诱导。故以最佳诱导培养基为基础，设计了增加6-BA浓度和降低NAA浓度的组合，最佳诱导培养基为对照（见表3）。

结果表明，愈伤组织转入分化培养基中后10 d，愈伤组织表面出现绿色凸起小颗粒，15 d时，小颗粒发育成芽点，30 d时，长出两片新叶。

愈伤组织转入分化培养基中后，CK组合有17.78%的愈伤组织分化出芽，平均每个出芽的愈伤组织分化3.44个芽，部分愈伤上有不定根发生（图2A）。随着6-BA浓度增加，愈伤分化率均有显著提升，F4-F9等6个处理的愈伤分化率均达到了90%以上，且处理间无显著差异。从分化愈伤的平均芽数来看，6个处理的平均芽数为5—7.71个之间，以F8愈伤组织分化培养基中的平均芽数最高。

但从不定芽的形态来看，不定芽数量多少与不定芽状态好坏之间相关性不大。F4愈伤组织分化培养基中的不定芽最为健壮（见图2B），叶片挺拔，背面毡毛清晰可见，基部愈伤黄色，质地坚硬，培养后期愈伤体积稍膨大，不定芽之间常伴有新芽点发生（见图2C），芽丛在切小后还可继续分化出芽。而随着F5和F6愈伤组织分化培养基中NAA浓度的增加，新生的不定芽叶片容易出现黄斑或黄边现象，部分芽点枯黄（见图2D）。而在6-BA浓度提高至0.90 mg·L⁻¹的F7愈伤组织分化培养基中，愈伤组织表面分化的芽点数进一步增加，但不定芽叶背面的毡毛数和厚度显著低于F4愈伤组织分化培养基中的不定芽，部分叶背面甚至没有绒毛（见图2E），在NAA浓度提高至0.30 mg·L⁻¹的F8愈伤组织分化培养基中，较小的不定芽玻璃化现象严重，叶片或叶柄透明化；在NAA浓度提高至0.45 mg·L⁻¹的F9愈伤组织分化培养基中的不定芽畸形现象加剧，不定芽或叶片与培养基接触部位常膨大，有愈伤化的迹象（见图2F）。

综上所述，WPM+0.75 mg·L⁻¹6-BA+0.15 mg·L⁻¹NAA+30 g·L⁻¹蔗糖为火草叶片愈伤组织分化的最佳培养基。

由于增殖培养基中的不定芽增殖率高，为避免芽苗在出根前增殖出新芽，因此在生根培养基中未添加6-BA。根据观察，芽苗在生根培养基中培养8 d时开始出现根原基（见图3A），15 d后根长2 cm（见图3B）。

Figure 3.  Rooting culture and transplanting of Gerbera delavayi seedlings
A-C: Seedlings of different time cultured in S3 rooting medium. A: 8 d, B: 15 d, C: 20 d; D: Rooting seedlings in S1 medium; E: Rooting seedlings in S2 medium; F: Rooting seedlings after transplanting 30d

S1-S3培养基的NAA浓度为0.1 mg·L⁻¹，IBA为0.1 mg·L⁻¹的S1号生根培养基中的芽苗平均生根率只有36.67%，显著低于S2和S3号生根培养基中芽苗的生根率，生根条数少，根细且无根毛，叶片颜色偏浅，甚至枯黄（见图3D）；IBA为0.5 mg·L⁻¹的S2号生根培养基中的芽苗平均生根率为75.33%，可生3—5条根，但无根毛或根毛不明显，叶片颜色和质地正常（见图3E）；当IBA为1.0 mg·L⁻¹的S3号生根培养基中的芽苗平均生根率达93.33%，显著高于所有的生根培养基中芽苗生根率，根系发达，能长出生根条数>5条的带根毛的粗壮根系（见图3C）。

S4-S6培养基的NAA浓度为0.2 mg·L⁻¹，当IBA为0.1 mg·L⁻¹时生根率41.33%与S1的36.67%的生根相当，植株生长状态相似；当IBA为0.5 mg·L⁻¹与1.0 mg·L⁻¹时，2个培养基的生根率83.33%与86.67%植株生根相当，但S6与S3根系都带根毛，植株健壮，生长快，炼苗移成活率较无根毛高。

综上所述，1/2DKW+1.0 mg·L⁻¹IBA +0.1 mg·L⁻¹NAA+30 g·L⁻¹蔗糖为火草生根的最佳培养基。

当生根苗高度达到4.0 cm以上时，经过室外炼苗和移栽后，20 d时存活率为95.0%（见图3F），表明建立了完整的火草组培再生技术体系。

利用当年生火草叶片为材料，在WPM+0.6 mg·L⁻¹6-BA+0.45 mg·L⁻¹NAA+30 g·L⁻¹蔗糖的培养基中培养30 d后，从叶片切口处诱导出直径0.5 cm、结构致密、质地硬的绿色愈伤组织。愈伤组织在WPM+0.75 mg·L⁻¹6-BA+0.15 mg·L⁻¹NAA+30 g·L⁻¹蔗糖的培养基中培养30 d后，愈伤组织平均分化率95.56%，分化愈伤组织表面平均芽数为5.78个芽。芽苗转入1/2DKW+1.0 mg·L⁻¹IBA +0.1 mg·L⁻¹NAA+30 g·L⁻¹蔗糖的生根培养基30 d后，可诱导出根系发达，由5—13条根组成的、带有根毛的根系，平均生根率可达93.33%。

实验结果表明，尽管火草的离体快速繁殖方法可以借鉴同属植物非洲菊的离体快速繁殖体系^[3,5]，但是火草的短缩茎和叶片背面密被白色的毡毛纤维的特点，导致初代培养过程中灭菌难度很大。一方面，酒精和升汞的处理时间较短的话，毡毛纤维中的真菌和细菌不易杀灭；另一方面，酒精和升汞的处理时间较长的话，外植体易受伤褐化^[1]。本实验通过设置不同的消毒时间处理，特别是经过洗洁精处理，能有效降低绒毛间的张力，去除大部分的微生物，经多次试验，以0.1%升汞溶液进行14 min消毒处理为最佳，污染率低。以叶片为外植体，不仅材料来源比幼芽更为方便，而且通过诱导愈伤来进行前期扩繁能够更有效地缩短繁殖周期，可以快速地得到大量增殖苗^[13]，不同于黄玉玲^[1]和陈菁^[17]以幼芽为外植体，增殖培养获得丛生芽。

激素类型和浓度是决定愈伤组织诱导成效和分化的关键。本研究借鉴了菊花研究的激素类型，设置了愈伤组织诱导、分化和生根的试验组合，并取得了较好的效果，筛选获得了相应的激素类型和浓度组合，最终获得的火草不定芽生根率高，与张春梅^[4]、张孟仁^[7]、何家涛^[8]等对非洲菊的研究结果基本类似。本研究的生根苗栽培基质为珍珠岩:草炭=1:1^[12]，通过控制空气湿度和光照^[15]，20 d时成活率达95%以上，并开始长出新叶，30 d后叶色浓绿长势旺盛，所用栽培基质与张春梅^[5]、樊晓亮^[6]等对非洲菊的移栽基质一致，与黄玉玲^[1]对火草的移栽基质配比有差异，但两个基质的移栽成活率均在95%以上。

综上所述，本研究以火草叶片为材料，建立间接器官发生，从而实现再生的技术路径，为火草工厂化育苗提供技术参考。