Genetic Differences Revealed by Genomic-SSR and EST-SSR Markers in <i>Alnus cremastogyne</i>

WANG Zeliang; YANG Yongzhi; DU Jincheng; CHEN Zhi; HUANG Zhen; GUO Hongying

doi:10.12172/202210080001

Volume 44 Issue 4

Aug. 2023

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WANG Z L, YANG Y Z, DU J C, et al. Genetic differences revealed by Genomic-SSR and EST-SSR markers in Alnus cremastogyne[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2023, 44(4): 36−42 doi: 10.12172/202210080001

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WANG Z L, YANG Y Z, DU J C, et al. Genetic differences revealed by Genomic-SSR and EST-SSR markers in Alnus cremastogyne[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2023, 44(4): 36−42 doi: 10.12172/202210080001

Genetic Differences Revealed by Genomic-SSR and EST-SSR Markers in Alnus cremastogyne

doi: 10.12172/202210080001

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1.
Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, China
2.
Sichuan Academy of Grassland Sciences, Chengdu 611731, China

Received Date: 2022-10-08
Available Online: 2023-03-21
Publish Date: 2023-08-30

Abstract

As a non-leguminous and nitrogen-fixing tree species, Alnus cremastogyne is also the most important endemic species of Alnus in China, which has important ecological functions. In this paper, the genetic differences of Genomic-SSR and EST-SSR markers in Alnus cremastogyne genome were analyzed. The results showed that the average number of alleles and the average number of effective alleles with EST-SSR were higher than those of genomic-SSR, while the average observed heterozygosity and average expected heterozygosity were higher than those of EST-SSR. Cluster analysis showed that there were differences between genomic-SSR and EST-SSR in small groups, which indicated that there were some differences between Genomic-SSR and EST-SSR in analyzing genetic diversity and genetic relationship to a certain extent, and more objective results could be obtained by combining the two marker methods.
- Alnus cremastogyne;
- SSR;
- Genetic diversity;
- Polyploid;
- GenoDive

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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桤木属（Alnus Mill.）为非豆科固氮树种，根系富含根瘤，可改良土壤，是重要的先锋造林与生态功能树种。桤木属是现存桦木科植物中最原始的属，也是北半球新生代植物区系的重要植物类群，主要分布在欧亚和北美，拉丁美洲与非洲有少量分布^[1-2]。四川省及邻近地区是桤木属的重要分布区，原生分布有桤木（Alnus cremastogyne, 又名四川桤木）、川滇桤木（A. ferdinandi-coburgii）、毛桤木（A. lanata）、尼泊尔桤木（A. nepalensis），可能是桤木属植物起源与分化的中心^[1]，其中桤木是我国最重要的一个特有种，也是研究最广泛的一个种，生长迅速、适应性强、童期短且结实量大，目前其适生栽培区域已扩大至长江中下游地区，是中国长江流域退耕还林工程、生态建设工程和混交造林的重要树种。

SSR（Simple sequence repeat，简单序列重复）分子标记具有分布广泛、多态性丰富、稳定、共显性等特点，自从被开发以来，在物种遗传改良上获得了广泛的应用。在桤木属植物SSR研究方面，Zhuk等最早开发出了桤木SSR引物^[3]。随后，Lance等通过筛选海岸桤木（A. maritima）基因组文库获得了19条桤木SSR引物^[4]。使用Lance开发的引物，Jones等人系统研究了美国濒危物种海岸桤木的遗传多样性与群体结构等，为其提供了的濒危保护理论基础^[5,6]。随后SSR技术逐渐的应用到其他桤木属树种中，这些树种的群体遗传变异基础与进化史也逐渐被深入揭示^[7-10]。目前国内桤木遗传改良研究主要集中于育苗、栽培等常规育种方面，在群体遗传变异研究上，主要通过表型鉴定方法进行^[11-14]，采用分子标记手段的研究较少，仅有卓仁英等建立了RAPD体系^[15]。在SSR分子标记方面，也仅有饶龙兵等基于桤木、欧洲桤木（A. glutinosa）、硬桤木（A. firma）转录组数据开发了适用于桤木属的SSR标记^[16]。总之桤木群体遗传变异缺乏分子水平上的数据支撑，影响了其保护与进一步的推广利用。

此外，SSR分子标记从来源上说包括Genomic-SSR与EST-SSR，分别来源于基因组数据与表达序列标签（Express sequence tags，EST）数据。本研究分析了2种来源的桤木SSR标记的差异，以期推动其在国内桤木遗传变异研究上的应用。

1. 材料与方法

1.1. 植物材料

采样群体为天然次生林，共包括13个群体（表1）。群体范围包括成都平原区、盆周山地区、盆地丘陵区、川西高山峡谷区和川西南山地区。群体取样单株之间相距至少50m，采集桤木新鲜叶片，硅胶干燥保存带回实验室。

群体编号 ID	地点 Location	群体数目 Size	经度 Longitude (E)	纬度 Latitude (N)	海拔范围 Elevation range/m
AA	美姑	8	103.08	28.30	1609–2352
AC	峨边	13	103.25	29.28	828–1180
B	泸定	12	102.13	29.77	1303–2343
F	冕宁	16	102.10	29.18	1884–1908
I	平武	11	104.50	32.30	845–1440
J	青川	12	105.14	32.41	552–1496
K	剑阁	13	105.45	32.16	569–808
N	巴中	24	106.63	31.68	368–591
Q	宣汉	10	107.62	31.55	482–998
S	金堂	12	103.80	30.74	740–960
T	邛崃	9	103.16	30.32	746–1118
U	沐川	16	103.71	29.15	500–530
V	峨眉山	8	103.33	29.59	650–1273

Table 1. Location and number of trees sampled in 13 Alnus Cremastogyne populations

1.2. DNA提取与PCR扩增

使用天根植物基因组提取试剂盒DNA（DP305）提取基因组DNA。

SSR扩增所用引物来源于2部分：（1）Genomic-SSR，公开发表文献中其它桤木属树种相关研究中使用的SSR引物^{[3-4, 17-18]}，10对引物；（2）EST-SSR^[19]，6对引物。具体信息见表2。

Locus	Repeat motif	Size range	Tm(^oC)	Na	Ne	Ho	Ht	Gst	Nm	Primer source
Acg3	(CT)3CC(CT)2CC (CT)13AT(CT)5	210-262	55	18.00	5.156	0.963	0.859	0.035	6.893	L3.1^[9]
Acg7	(AG)11	265-293	56	13.00	3.897	0.939	0.791	0.028	8.679	Alma7^[10]
Acg8	(AG)12	177-217	56	16.00	4.093	0.829	0.804	0.016	15.375	Alma12^[10]
Acg11	(GT)12(GA)10	248-256	58	5.00	2.249	0.884	0.582	0.002	124.75	Alma20^[10]
Acg16	(AG)14	156-168	60	7.00	4.422	0.854	0.832	0.034	7.103	CAC-A105^[17]
Acg19	(TC)15	130-138	58	5.00	2.724	0.893	0.663	0.006	41.417	CAC-B113^[17]
Acg20	(GA)12	142-196	58	25.00	2.564	0.652	0.656	0.031	7.815	CAC-C118^[17]
Acg21	(TC)12	247-287	58	20.00	6.111	0.994	0.871	0.013	18.981	Ag01^[18]
Acg22	(TC)11	184-210	58	8.00	3.101	0.963	0.720	0.026	9.365	Ag05^[18]
Acg23	(TG)12	248-280	58	14.00	3.468	0.518	0.763	0.017	14.456	Ag09^[18]
均值				13.10	3.779	0.849	0.754	0.021	11.655
Ace1	(TC)11n(TC)8ta (TC)6	220-248	60	13.00	1.768	0.560	0.467	0.020	12.250	FQ338662^[19]
Ace3	(CT)12(CA)6	210-240	60	11.00	3.778	0.939	0.794	0.042	5.702	FQ335170^[19]
Ace27	(CT)13(CA)7	155-185	58	15.00	7.113	0.988	0.884	0.002	124.750	FQ351578^[19]
Ace29	(TC)26	219-285	58	27.00	8.467	0.994	0.934	0.010	24.750	FQ344263^[19]
Ace35	(TC)20	194-200	58	4.00	1.670	0.713	0.468	0.087	2.624	FQ334282^[19]
Ace37	(GA)19	119-137	58	10.00	1.402	0.415	0.314	0.029	8.371	FQ351410^[19]
均值				13.33	4.033	0.768	0.643	0.027	9.009
总均值				13.19	3.874	0.819	0.713	0.025	9.750
Na: 等位基因数; Ne: 有效等位基因数; Ho: 观察杂合度; Ht: 期望杂合度; Gst: 分化系数; Nm: 基因流 Na: number of alleles; Ne: number of effective alleles; Ho: observed heterozygosity; Ht: expected heterozygosity; Gst: differentiation coefficient; Nm: gene flow

Table 2. Genetic diversity of 164 trees in A. cremastogyne revealed by 10 Genomic-SSRs and 6 EST-SSRs

SSR上游引物添加FAM荧光标记。PCR扩增使用Takara Taq 聚合酶(Takara, Dalian, China) ，20 uL反应体系包括： 13.85 μL ddH₂O, 2.0 μL 10 × buffer, 2.0 μL 2.0 mM dNTP, 0.5 μL of each primer (at 10 μM), 1 μL基因组DNA模版（30-50ng）， and 0.75 U Taq DNA聚合酶。扩增程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，退火温度退火20 s，72 ℃延伸40 s，25-30个循环；72 ℃延长5 min，4 ℃保存。退火温度根据文献或引物设计软件给出的数据。PCR产物进行毛细管荧光电泳分型，SSR片段长度由软件GeneMarker version 2.2.0 (SoftGenetics, USA)判读。

1.3. SSR数据统计分析

首先利用Excel2007整理整合GeneMarker输出的基因型分子量数据，随后数据输入基于R环境的Polysat 1.6软件^[20]，整合相关信息后，最后输出为GenoDive格式文件进行进一步分析。利用GenoDive 2.0b27^[21]计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、总望杂合度（Ht）、固定系数（Gst，同Fst）等遗传参数，评价各群体的遗传多样性水平。基因流值（Nm）根据公式（1-G_ST）/（4G_ST）估算^[22]。

利用GenoDive 2.0b27计算Nei’s（1978）遗传距离，运用NTSYS-pc 2.10s 软件生成UPGMA聚类图并计算各遗传距离的相关系数^[23-24]。

3. 讨论

3.1. 桤木倍性

在相关研究中，欧洲桤木是被作为二倍体树种进行研究的，随后Lepais等^[7]与Mandák等^[25]在非洲与欧洲分别发现了四倍体群体（2n=4x=56）。在染色体水平上，任保青等^[26]与杨汉波等^[27]通过核型研究发现桤木染色体数为56，根据洪德元提到桤木属的染色体基数为x=14^[28]，或Murai认为的X=7^[29]，则桤木可能是四倍体或八倍体。而核型分析显示桤木染色体结构相同的染色体对数多数为2对^[27]，表明桤木可能正在进行或接近完成二倍体化。由于本研究种桤木SSR分型数据表现出了四倍体特性，因此本研究以多倍体分析软件Polysat、Genodive为基础^{[20, 21]}，结合NTSYS软件进行了桤木群体遗传参数估算与分析。

3.2. 桤木Genomic-SSR与EST-SSR差异比较

本研究对两种来源SSR标记的遗传差异进行了比较分析，结果显示：平均等位基因数与有效等位基因数EST-SSR标记高于Genomic-SSR标记，而两种杂合度Genomic-SSR位点高于EST-SSR位点，与前人研究结果均不完全一致。如在宋跃朋等与刘果等分别对杨树与桉树的研究中，均显示Genomic-SSR标记的等位基因数、多态性、杂合度高于EST-SSR标记^[30,31]，而在张亚东等对杨树研究则显示EST-SSR标记等位基因数、多态性、杂合度高于Genomic-SSR标记^[32]，而大豆相关研究则显示Genomic-SSR的等位基因数高于EST-SSR标记，但是EST-SSR标记的多态性稍高于Genomic-SSR^[33]。在对桤木群体遗传多样性的解析中，Genomic-SSR与EST-SSR分析结果也不一致。尽管理论上由于EST-SSR引物来自高度保守的DNA转录区，其揭示的多态性在理论上应低于基因组SSR标记，但由于试验材料与参试标记的不同，其显示的遗传差异可能不同。因此，在物种遗传多样性的研究中，应利用不同来源的分子标记进行综合评价，以获得更加客观的结论。

在对桤木群体遗传关系的分析中，在大的类群上Genomic-SSR与EST-SSR标记相一致，而在进一步的小类群上则显示出差异，而且本研究中两种标记计算的综合相关系数与Genomic-SSR标记更为相似，表明本研究中Genomic-SSR能更准确地揭示桤木不同群体或个体间的遗传关系，与前述宋跃朋等、刘果等与张亚东等研究结果不一致，这3项研究均显示EST-SSR能更准确地揭示基因型之间的遗传关系^[30-32]。这可能与研究所用材料有关，这3项研究分析的均是杨树与桉树不同种间的遗传关系，而本研究材料为桤木的不同群体，由于EST-SSR来自DNA转录区，保守性强，对亲缘关系较近的基因型灵敏度不及基因组SSR，但在近邻的种间具有通用性，对不同种属系统演化研究、加密遗传连锁图谱、基因精细定位、标记功能研究等具有重要作用。

总之，本研究表明桤木Genomic-SSR与EST-SSR标记在解析群体遗传多样性与遗传关系方面有一定差异，要得到更准确的结果，需要综合使用两种标记。

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标记 Marker	Genomic-SSR遗传距离 Genetic distance of Genomic-SSR	EST-SSR遗传距离 Genetic distance of EST-SSR
Genomic-SSR	1
EST-SSR	0.908^**	1
Genomic-SSR+EST-SSR	0.975^**	0.966^**
注: ^*表示在 0.01水平相关显著。　　Note: * indicates significant correlation at 0.01 level.

群体	gSSR				eSSR				gSSR+eSSR
群体	Na	Ne	Ho	Ht	Na	Ne	Ho	Ht	Na	Ne	Ho	Ht
AA(美姑)	7.90	4.664	0.875	0.763	8.50	4.788	0.875	0.739	8.125	4.631	0.875	0.747
AC(峨边)	7.10	3.555	0.831	0.711	6.67	4.304	0.718	0.609	6.938	3.756	0.788	0.663
B(泸定)	7.70	4.584	0.875	0.782	7.00	4.084	0.792	0.667	7.438	4.366	0.844	0.736
F(冕宁)	9.60	4.920	0.913	0.785	9.83	5.328	0.854	0.743	9.688	4.961	0.891	0.762
I(平武)	7.10	3.318	0.827	0.707	5.33	3.401	0.682	0.560	6.438	3.295	0.773	0.646
J(青川)	6.10	3.711	0.808	0.694	5.50	3.740	0.833	0.619	5.875	3.669	0.818	0.660
K(剑阁)	6.60	3.522	0.846	0.694	7.00	4.499	0.756	0.605	6.75	3.806	0.813	0.656
N(巴中)	8.20	3.683	0.821	0.693	8.33	4.918	0.75	0.570	8.25	4.11	0.794	0.644
Q(宣汉)	6.60	3.578	0.840	0.692	6.50	4.109	0.767	0.578	6.562	3.691	0.813	0.641
S(金堂)	6.90	4.088	0.842	0.723	5.67	3.581	0.722	0.576	6.438	3.798	0.797	0.657
T(邛崃)	6.50	3.847	0.911	0.749	6.00	4.127	0.852	0.663	6.312	3.853	0.889	0.707
U(沐川)	7.90	4.055	0.838	0.718	7.83	4.457	0.719	0.552	7.875	4.072	0.793	0.648
V(峨眉山)	6.10	3.708	0.850	0.746	5.67	3.933	0.708	0.556	5.938	3.694	0.797	0.665
均值	7.254	3.941	0.852	0.727	6.910	4.251	0.771	0.618	7.125	3.977	0.822	0.679
Na: 等位基因数; Ne: 有效等位基因数; Ho: 观察杂合度; Ht: 期望杂合度. 　　Na: number of alleles; Ne: number of effective alleles; Ho: observe the heterozygosity; Ht: Expected heterozygosity.