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油樟（Cinnamomum longepaniculatum（Gamble）N.Chao ex H.W.Li），是樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）[1]香料植物[2]。油樟的枝、叶、根、果和花等部位均富含芳香精油，油樟叶中挥发油含量可达到3.8~4.5%[3]，现已从油樟叶精油中鉴定出113余种化学成分[4]。因油樟具有良好的医用价值和芳香气味，现正受到人们越来越多的关注，其在香料、医药、和化学工业等领域也被广泛应用。油樟主要分布于四川宜宾，约占全国油樟资源85%、全世界油樟资源65%[5]。目前油樟主要通过扦插、嫁接、种子等多种类型繁殖[6]，而扦插与嫁接存在诸多影响因素，目前油樟栽培以种子繁育为主。且目前油樟种植品种出油率差异明显，良种化程度不高。由于油樟母树缺乏，导致优良种子收集困难[7]，而油樟试管苗易玻璃化，不利于工厂化育苗[8]。目前经过湿沙层积的油樟种子发芽率低，且沙藏后种子出苗差、活力弱、萌芽周期长，且保存有限。油樟种子的萌发及生长在一定程度上影响油樟种植与品质，因此通过解决油樟种子、种苗问题能够有效促进油樟经济的快速发展。
外源激素会影响种子的萌发 [9]，赤霉素能够促进种子萌发[10]。赤霉素可以有效促进种子内水解酶的活性，增强种子活力[11]，其不仅能够加速植物的生长和发育，还能够打破某些植物块茎、种子、鳞茎等器官的休眠，促进发芽[12]。不同浓度赤霉素对植物种子具有不同的效果，1~10 umol·L-1赤霉素可以有效缩短生菜种子培育期限[13]，750~1 250 mg·L−1赤霉素处理36 h托鲁巴姆种子显著提高发芽势和发芽率[14]，400 mg·L−1赤霉素显著提高白藤种子的发芽速度[15]，200 mg·L−1赤霉素浸种增加色木槭的萌发率[16]。100 mg·L−1赤霉素浸泡6 h能有效促进枫香种子萌发[17]。
目前油樟研究主要集中在油樟精油成分[18]、油樟内生菌[19]、油樟油体外抑菌活性研究[20]及提高精油提取技术[21]等方面，而外源激素能否促进油樟种子萌芽以及种子萌芽过程中各项生理指标如何变化还未有深入研究。因此利用不同浓度赤霉素处理油樟种子，比较赤霉素处理后种子各项生理变化与形态学变化，并以此为基础筛选出能够有效促进油樟种子萌发的赤霉素浓度，缩短油樟种子萌发周期，提高油樟的成苗率，促进油樟优质种质资源筛选及丰富油樟苗木快速繁殖的理论基础。
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油樟种子2020年9月采收于宜宾市梦想农旅有限公司油樟基地后沙藏保存。挑选饱满、大小均一种子清洗表面沙土后待处理。
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以蒸馏水浸泡油樟种子作为对照，设置4个赤霉素浓度梯度（0.2 g·L−1、0.4 g·L−1、0.6 g·L−1、1 g·L−1）和2个浸泡处理时间（24 h、48 h），每个处理设置3组生物学重复，每个重复为150粒种子。油樟种子SOD、POD、CAT活性分别采用氮蓝四唑（NBT）光还原法[22,23]、愈创木酚法[24,25]、紫外分光光度测定法[25]测定。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法[25]测定。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法[26]测定。胚及胚乳形态结构采用徒手切片[27]与石蜡切片法[28]观察。
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采用 Microsoft Excel 2010 软件进行表格制作，采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析和显著性分析（P<0.05）。
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分析不同浓度赤霉素处理对油樟种子胚乳结构的影响（见图1）。结果表明油樟种子富含油脂（图中红色圆点即为脂滴）。而0.4 g·L−1赤霉素处理48 h后，油樟种子内脂滴含量、胚乳细胞的连接密度均高于对照（见图1B），且胚乳细胞壁相比对照明显变薄。
Figure 1. Paraffin sections of Cinnamomum longepaniculatum seeds
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油樟种子种胚长度约为种子长的1/4，位于胚乳中央的一端。沙藏后的油樟种子已处于子叶型胚阶段（见图2）。通过比较不同浓度、不同时间处理油樟种子胚的变化情况，能够较清楚地观察到0.4 g·L−1赤霉素处理48 h后油樟种子的种胚长度、子叶长度、胚轴长度均大于其他处理组，其胚根也更接近种皮，有利于种子萌发（见图2F）。观察胚的形态结构可知，0.4 g·L−1赤霉素溶液浸泡油樟种子48 h，有利于油樟种胚的发育生长，为胚根突破胚乳创造条件，一定程度上缩短油樟萌发周期，能够有效帮助油樟种子萌发。
Figure 2. Effects of GAs on the embryo structure of Cinnamomum longepaniculatum seeds
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不同浓度赤霉素处理不同时间，能够显著影响油樟种子可溶性蛋白含量。在处理24 h后，赤霉素较高浓度（0.4 g·L−1、0.6 g·L−1、1.0 g·L−1）能够显著提高种子可溶性蛋白含量，其中0.6 g·L−1处理可溶性蛋白含量最高，为7.00 mg·g−1，而对照组中可溶性蛋白含量最低，为4.60 mg·g−1（见图3）。随着赤霉素处理时间的增加，处理48 h后赤霉素0.4 g·L−1处理下可溶性蛋白含量最高，为7.48 mg·g−1，显著高于对照。而赤霉素其他浓度处理（0.2 g·L−1、0.6 g·L−1、1.0 g·L−1）可溶性蛋白含量相比其他处理显著下降，其中0.6 g·L−1最低，为6.08 mg·g−1（见图3）。
Figure 3. Effects of different concentrations of GAs on Protein content
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赤霉素处理24 h后，对照SOD活性最低，为608.50 U·g−1FW−1。赤霉素0.2 g·L−1、0.6 g·L−1和1 g·L−1处理种子，SOD活性分别比对照高8.22%、2.79%和6.27%，赤霉素浓度为0.4 g·L−1时，油樟种子SOD活性最高，为700.00 U·g−1FW-1（见图4）。
Figure 4. Effects of different concentrations of GAs on SOD activity
处理48 h后，随着处理时间的增加，较高浓度赤霉素处理能够显著提高油樟种子内SOD活性，当赤霉素浓度为0.6 g·L−1时，SOD活性最高，为856.70 U·g-1FW−1，而0.4 g·L−1和1 g·L−1分别比对照组升高了4.31%和5.53%（见图4）。0.2 g·L−1处理与对照SOD活性最低且无显著性差异。实验结果表明，在赤霉素较高浓度下，油樟种子内SOD活性随着浸泡时间的增加而增加，而0.4 g·L−1能够在短时间内提高SOD活性，随着处理时间的增加，0.6 g·L−1可提升油樟种子SOD活性。
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与对照相比，0.6 g·L−1赤霉素可提高油樟种子内POD活性，而其他浓度处理与对照无显著性差异。当赤霉素为0.6 g·L−1，处理24 h和48 h后油樟种子POD活性分别为11.25 U·g−1FW−1、13.33 U·g−1FW−1（见图5），显著高于其他处理。1.0 g·L−1赤霉素处理在24 h略低于对照，而在处理48 h后显著高于对照及赤霉素低浓度处理。
Figure 5. Effects of different concentrations of GAs on POD activity
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油樟种子CAT活性变化受赤霉素浓度的影响（见图6）。处理24 h和48 h后，0.4 g·L−1赤霉素显著提高CAT活性。随着处理时间的增加，48 h处理比24 h处理CAT活性升高7.24%（见图6）。而其他处理与对照无显著性差异，且与处理时间无关。
Figure 6. Effects of different concentrations of GAs on CAT activity
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实验结果表明不同浓度赤霉素能够影响油樟种子丙二醛含量。在较低浓度处理下（0.4 g·L−1）丙二醛含量均低于对照，其中赤霉素0.4 g·L−1处理在24 h、48 h丙二醛含量均显著低于对照，分别为0.026 μmol·g−1FW−1（见图7）、0.021 μmol·g−1FW−1（见图7）。对照与其他赤霉素处理MDA含量较高。随着处理时间的增加，0.6 g·L−1处理下MDA含量上升较快。
Figure 7. Effects of different concentrations of GAs on MDA
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赤霉素浓度能够有效影响种子萌发，赤霉素处理色木槭、泡桐、枫香等[29,30,17]能有效增加种子的萌发。种子内胚乳细胞的结构，脂滴和蛋白体的含量对种子的萌发均有影响，即种子内胚乳细胞连接紧密，脂滴大量分布，会使种子难以萌发[33]。而蛋白体是种子贮藏蛋白的场所，在种子萌发时，蛋白体吸水能够创造适合水解酶发挥活性的微环境，使蛋白体中的物质水解，为胚的生长发育提供帮助[34]。通过切片观察，0.4 g·L−1赤霉素处理油樟种子胚乳细胞中脂滴丰富，而其他种子研究表明丰富的脂滴会阻断种胚吸收营养物质和水，其还会阻断相关呼吸酶的表达[35]，这与本论文研究不一致，脂滴含量是否影响萌发，如何影响种子萌发有待进一步研究。
在自然环境条件下，植物会通过非酶系统（抗氧化剂）和自身抗氧化酶系统在不利生长条件下对体内的活性氧进行清除，以此来维持自身正常的生长发育。赤霉素能够有效缓解泡桐种子盐胁迫效果，显著缓解NaCl对泡桐种子和幼苗生长的抑制作用[29]。在植物的抗氧化酶系统，即SOD，POD，CAT是衡量植物抗氧化能力的重要指标，它们被用于维持代谢平衡、清除自由基、抵抗逆境胁迫[36]。MDA是脂质过氧化物的产物[37]。SOD是广泛存在于动植物体内的保护酶，主要起催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，消除O2−对细胞的损害，SOD在维持细胞活性氧代谢平衡中起着重要作用[25]。油樟种子在赤霉素处理后SOD活性提高，延缓油樟种子的快速衰老，使油樟种子保持一定的生物活性有利于油樟种子的发芽，表明GA在打破种子休眠的同时，还可以提升种子中SOD活性，有效降低种子在休眠过程中产生的活性氧，促进油樟种子萌芽。POD具有催化过氧化物分解的作用，使过氧化物对植物细胞膜的伤害降低，以此来提高植物的抗逆性[22]。不同浓度赤霉素处理后，0.6 g·L−1赤霉素可有效提升POD活性，其他处理POD活性与对照无显著差异，表明赤霉素在一定浓度下能够提高油樟种子的抗逆性，降低过氧化物对种子细胞膜伤害，保持油樟种子活性。CAT具有催化过氧化氢分解为水和分子氧的作用，保护生物机体的作用[24]。因此CAT活性高能够使油樟种子得到较好的保护即能够使油樟种子维持其生物活性，保持一个良好的萌芽状态，有效促进油樟种子萌发。
植物种子内可溶性蛋白含量的高低在一定程度与植物种子活力的高低成正比[38]，0.4 g·L−1赤霉素处理下油樟种子48 h油樟种子可溶性蛋白含量最高，此时油樟种子的活力最高，可最有效帮助油樟种子的萌芽。MDA含量可以在一定程度上反映植物受氧化伤害的程度，同时MDA含量与植物逆境伤害和植物衰老有着密切的关系[12]，MDA含量越大对油樟种子的伤害越大[39]。0.4 g·L−1赤霉素处理油樟种子能够有效降低丙二醛含量，降低油樟种子在休眠过程中产生的各种氧化伤害，利于油樟种子的萌发。
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油樟种子的种皮坚硬，发芽周期较长，本实验通过不同浓度赤霉素处理，可在一定程度上提升油樟种子内SOD、POD和CAT活性，其中，0.4 g·L−1赤霉素能够短时间内显著提升油樟种子SOD总活性，而POD在0.6 g·L−1处理下最高，0.4 g·L−1赤霉素可显著提升油樟种子CAT活性，且0.4 g·L−1赤霉素处理下油樟种子丙二醛含量最低。0.4 g·L−1赤霉素处理油樟种子胚乳细胞连接密度较小、脂滴含量较多、细胞壁较薄，其胚的长度、子叶长度、胚轴长度最大，胚根更易突破种皮。综上所述，0.4 g·L−1赤霉素处理油樟种子48 h有利于种子萌发。
Effects of Gibberellin with Different Concentrations on Physiological and Germination of Cinnamomum longepaniculatum Seeds
doi: 10.12172/202206300001
- Received Date: 2022-06-30
- Available Online: 2023-02-24
- Publish Date: 2023-06-25
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Key words:
- Gibberellin /
- Cinnamomum longepaniculatum seeds /
- Seed embryo /
- Physiological index
Abstract: Cinnamomum longepaniculatum is a second-class key protected plant in China, and it is also an economic forest rich in natural aromatic oil, which is unique to China. Currently, there were few studies on Cinnamomum longepaniculatum seeds, and there was no in-depth study on how the germination rate and physiological index of Cinnamomum longepaniculatum seeds change after gibberellin treatment. In order to promote the rapid germination of Cinnamomum longepaniculatum seeds, the plant growth regulator GAs was used to treat them. Through the determination of various physiological index and the observation of morphological structure, the theoretical basis of Cinnamomum longepaniculatum seeds germination could be further enriched. Taking Cinnamomum longepaniculatum seeds as the experimental materials, four concentrations of GAs (0.2 g·L−1, 0.4 g·L−1,0.6 g·L−1,1 g·L−1) treat the seeds for 24 h and 48 h, the physiological indexes and embryo development were compared. The results showed that 0.4 g·L−1 gibberellin treatment could significantly increase SOD and CAT activities, significantly decreased MDA content and significantly increased soluble protein content in Cinnamomum longepaniculatum seeds. The morphological development of embryos was obviously better than other treatments, and the endosperm cell connection density was smaller, the lipid droplets content was higher and the cell wall was thinner. Therefore, soaking seeds with 0.4 g·L−1GAs for 48 h was beneficial to promote the germination of Cinnamomum longepaniculatum seeds.
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