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细枝木麻黄（Casuarina cunninghamiana）属于木麻黄科（Casuarinaceae）木麻黄属常绿乔木，具有耐干旱、耐瘠薄、抗盐碱生物固氮等特性[1]。随着不断深入研究，木麻黄属植物已经运用在固氮改土、盐碱地植被恢复和建立农林复合系统等方面[2]。有研究表明木麻黄对铅的耐受浓度可达1800 mg·kg−1[3]。经本课题组预实验发现细枝木麻黄在600 mg·kg−1铅处理下受到胁迫但不致死。
Frankia菌作为放线菌中的一个属，可以与非豆科植物共生结瘤[4]。作为木麻黄属植物重要的共生菌，Frankia菌在固定氮素、培肥地力、提高植物生长势和土壤生态修复等方面有着独特优势，目前已有研究表明木麻黄属植物和Frankia菌之间的生物组合与木麻黄属植物的固氮量密切相关[5]。另有研究表明Frankia菌株体内具有结合重金属的蛋白质，因此具有积累Pb等重金属的特性[6-9]。
铅（Pb）毒性强、持久，残留在土壤中可严重危害动植物生长。研究表明，随着Pb进入土壤，土壤中的酶活性、土壤微生物生物量碳和微生物活性等都能受到一定抑制，土壤的理化性状受到一定程度的影响[10]。近些年，我国重金属污染土壤修复技术发展迅速，不断创新，常见的例如：隔离包埋技术，固化稳定技术，氧化还原技术，微生物修复技术和植物修复技术等[11]。
随着对Frankia菌的相关研究越来越深入，大量研究证明Frankia菌与木麻黄属植物建立共生关系可以提高木麻黄对干旱、盐碱、金属毒害的抗性[12]。其中有研究证明木麻黄属植物可以积累大量重金属，且各林龄木麻黄对重金属均有很好的富集作用，且根是木麻黄属植物富集重金属的主要部位[13，14]。然而，关于Frankia菌与木麻黄属植物细枝木麻黄共生体系对土壤Pb污染的响应的影响还鲜有报道。本研究通过盆栽试验，分析接种Frankia菌对细枝木麻黄结瘤量、矿质元素吸收，丙二醛、渗透调节物质含量及其根系活力的影响，以期为Frankia菌接种到植物中增加植物对重金属的抗性提供理论基础。
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栽培基质：由珍珠岩、蛭石按体积比1∶1混合而成，试验基质预先经过110 KPa、121℃高压蒸汽灭菌2 h以确保杀死其他杂菌，备用。
细枝木麻黄（Casuarina cunninghamiana）苗木从广州海田树业有限公司购入，栽种于以草木灰为基质的塑料盆内，对其进行常规管理，待其生长出足够的枝条，采取长势一致、半木质化的枝条进行水培生根[14]，至根长约5 cm作为供试苗。
Frankia casuarinae菌株购自德国莱布尼茨研究所“德国微生物菌种保藏中心”。实验所用菌根接种剂是将购入冻干粉菌种进行扩大培养，经离心收集后轻微匀浆，用蒸馏水稀释成为的菌悬液。
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试验于2018年五月底至2021年二月在四川农业大学风景园林学院设施大棚内进行。在同一Pb浓度处理的条件下，试验设3个Frankia菌梯度：0 mg·株−1（CK）、10 mg·株−1、20 mg·株−1处理，每个处理3次重复，每个重复8株，共72株苗木。将细枝木麻黄水培苗部分根尖剪去0.5～1 cm，在菌悬液中浸泡过夜，栽种于塑料花盆（直径16 cm），每盆基质150 g，将浸泡根系后的菌悬液环绕浇在根部，置于28℃下培养3个月，每星期每株苗施无氮霍格兰营养液100 mL。接种后每月观察结瘤情况。对照不施肥，3个月后测苗高、地径，用水洗净根部，计数根瘤个数。
接种3个月后，每5 d对每株细枝木麻黄施加Pb浓度为600 mg·kg−1的醋酸铅溶液，以分析纯的 (CH3COO)2Pb溶于蒸馏水中，环形浇施。28℃常规管理30 d后进行相关生理指标的测定。
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Pb胁迫处理后，将细枝木麻黄苗木小心取出，将干燥的植物样品与土壤样品研磨至通过1.5 mm筛，植物样品采用HNO3-HClO4法消化（V∶V=5∶1），待测液用AA-700原子吸收分光光度计（岛津，日本）测得细枝木麻黄枝条的Pb、K、Ca、Mg、Cu、Mn含量。
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参考郑炳松[15]硫代巴比妥酸法与考马斯亮蓝法分别测定细枝木麻黄地上部分丙二醛(MDA)含量与可溶性蛋白（Soluble Proteins，SP）含量，参考李合生[16]磺基水杨酸提取茚三酮显色法测定叶片游离脯氨酸（Proline）含量；蒽酮比色法测定可溶性糖（Soluble Sugar，SS）含量；采用甲醇浸泡法测根系活力。
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Excel 2019统计软件用于数据统计与绘图，SPSS24.0软件用于分析数据，采用单因素方差分析（OneWay ANOVA)，Duncan法进行多重比较，Pearson法进行相关性分析（双尾检验）。
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由表1可知，在600 mg·kg−1Pb胁迫下，施用Frankia菌20 mg·株−1时，细枝木麻黄结瘤量相比接种10 mg·株−1增加了33.32%，接种Frankia菌10、20 mg·株−1，结瘤率均为100%。
处理/（mg·株−1）
Treatment
(mg per plant)结瘤量/个
Nodulation number
per plant结瘤率/%
Nodulation rate0 0 0 10 21 100% 20 31 100% 注：图中结瘤量为平均值。
Note: The number of nodules in the figure is the average of all the treatments.Table 1. Effect of Frankia bacteria on nodulation amount of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment
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由图1分析可得，在相同Pb处理下，随着接种量的增加，细枝木麻黄体内矿质元素出现了不同的趋势：与CK相比，10~20 mg·株−1Frankia菌处理细枝木麻黄枝条中Pb含量显著下降（P<0.05），20 mg·株−1处理时，Pb含量相比对照下降了58.06%；图2表明K含量在10 mg·株−1处理时达到最低值，仅为对照的66.95%，当接种量上升到20 mg·株−1时，K含量升高到对照的84.83%，与对照差异不显著；Cu含量随Frankia菌浓度升高呈现先上升后下降的趋势，10 mg·株−1处理时，Cu含量达到最大值，比对照上升了64.0%。
Figure 1. Effects of Frankia bacteria on Pb accumulation in aboveground part of Casuarina cunninghamiana under Pb, Cu and Mn stress
Figure 2. Effects of Frankia bacteria on K, Ca and Mg contents in aboveground part of Casuarina cunninghamiana under Pb stress
由表2分析可得，在相同浓度的Pb胁迫下，Frankia菌接种量与细枝木麻黄枝条中Pb含量呈极显著负相关，细枝木麻黄枝条中Pb含量与Mn、K元素含量呈显著正相关，说明Frankia菌接种量可以与细枝木麻黄地上部Pb含量变化有着密切的关系。
Frankia菌接种量
Frankia inoculationPb Cu Mn Ca Mg K Frankia菌接种量
Frankia inoculation1 Pb −0.879** 1 Cu 0.201 −0.274 1 Mn −0.398 0.744* −0.205 1 Ca −0.625 0.655 0.288 0.663 1 Mg −0.299 0.410 0.432 0.486 0.785* 1 K −0.342 0.715* −0.410 0.961** 0.500 0.399 1 注：*.在0.05水平（双尾）相关性显著；**.在0.01水平（双尾）相关性显著。
Note: * indicates the correlation is significant at 0.05 level (double tail); * * indicates the correlation is significant at 0.01 level (double tail).Table 2. Correlation between metal content in aboveground part of Casuarina cunninghamiana and inoculation amount of Frankia
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由表3分析可得，当Frankia菌浓度为10 mg·株−1时，MDA含量相比对照显著上升了22.87%，20 mg·株−1处理时，MDA含量相比对照下降了37.51%（P < 0.05）。
Frankia接种量 Frankia inoculation/ (mg·株−1) 丙二醛MDA/（nmol·g−1FW） 游离脯氨酸Pro/（µg·g−1） 可溶性糖SS/（µg·g−1） 0 13.63±1.10b 34.51±9.22a 26.52±0.30a 10 16.75±1.28a 26.25±5.22ab 16.68±0.29c 20 8.51±0.73c 15.17±1.09b 23.84±1.39b 注：表中数值为平均值±标准误，同列数据中不同字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。
Note: The values in the table are mean ± SE, and different letters in the same column indicate significant differences between treatments (P < 0.05).Table 3. Effects of Frankia bacteria on stress physiological index of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment
表3分别显示了Pb胁迫下，不同接种量细枝木麻黄枝条中游离脯氨酸与可溶性糖的含量。可溶性糖含量随着接种量的上升，呈现先减少后升高的趋势，接种量为10 mg·株−1时，可溶性糖比对照组下降了37.10%；接种量为20 mg·株−1时，可溶性糖含量相比对照下降了10.10%。接种量为10 mg·株−1时，游离脯氨酸小幅上升，但与对照差异不显著，接种量上升到20 mg·株−1时，游离脯氨酸显著变化（P < 0.05），相比对照降低了56.04%。
图3显示了，Frankia菌接种量为10 mg·株−1时，细枝木麻黄根系活力小幅增强；接种量为20 mg·株−1时细枝木麻黄的根系活力TTC还原强度最强，与对照相比上升了87.12%。
Figure 3. Effect of Frankia bacteria on root activity of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment
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植物根系作为直接与Frankia菌接触的器官，在一定浓度范围内，随着接种量的增大，植株接种效果越好[17]，本试验结果表明，在600 mg·kg−1Pb胁迫下，接种Frankia菌可以使其全部结瘤，且高接种量Frankia菌（=20 mg·株−1）时，结瘤数量上升明显，这一结果与李遥研究Frankia菌接种量对桤木生长的影响一致。
植物从土壤中吸收重金属，并把它们固定在根部，限制重金属向地上部分转移[18]。本试验中随着接种量的增加，细枝木麻黄枝条Pb含量明显减少。这与苏芳芳[19]双接种（AMF与Frankia菌）杨梅叶片中Pb含量的变化一致。可能是因为木麻黄根限制重金属进入地上部分，而与Frankia菌的结合增加了对重金属的富集作用[13，19]。Mn可以维持叶绿体膜正常结构，并且直接参与光合作用[20]，Mg离子螯合酶将Mg离子插入到原卟啉中，进一步反应形成最终产物叶绿素[21]，这两种必须元素对植物光合作用有重要影响。与CK相比，本试验中施用不同量的Frankia菌细枝木麻黄地上部Mn含量变化与Mg含量变化均不显著，这说明Frankia菌可能对细枝木麻黄光合作用无影响。
丙二醛（MDA）作为膜脂过氧化的产物之一，是植物遭受逆境伤害程度的重要指标，其积累能够加剧膜脂过氧化作用，增加植物体内的活性氧、打破活性氧的代谢平衡以应对逆境胁迫[22，23]。刘慧芹[24]等的研究认为随着胁迫时间及Pb浓度的增加，黑麦草幼苗体内MDA含量与Pb浓度呈线性正相关(r2>0.96)。本试验结果表明，在Pb胁迫下，Frankia接种量为20 mg·株−1时，MDA含量有明显的降低，表明高接种量细枝木麻黄细胞膜脂过氧化作用有所减缓，Frankia菌可以通过降低细枝木麻黄体内的MDA的含量来抵御Pb胁迫。但是接种量较低时，细枝木麻黄细胞受损程度反而比对照组升高，这与前人研究结果不一致，其原因有待进一步研究。
游离脯氨酸作为蛋白质的一种重要组分，会在植物受到胁迫时随着蛋白质的分解释放出来，增加细胞质的浓度以维持细胞代谢活动[25]。可溶性糖、游离脯氨酸是植物体内的渗透调节物质，植物在遭受逆境的时候通常会通过积累可溶性糖、游离脯氨酸等渗透调节物质抵御逆境胁迫[26]。毛雪飞[27]等的研究认为，在一定范围内随着Pb浓度的增加，游离脯氨酸、可溶性糖含量有所增加。不同植物体内可溶糖含量的变化较为复杂[24]。本试验结果表明接种了Frankia菌的细枝木麻黄积累的可溶性糖更少，游离脯氨酸的积累量也更低。
根系是植物吸收土壤水分和养分的重要器官，可以直接影响植物的正常生长[28]。土壤重金属向植物根部迁移是植物吸收累积重金属的重要途径[29]，重金属胁迫后植物的根系活力能表现出该植物对重金属的逆境胁迫处理的机体反应[30]。本试验中，Frankia菌接种量达20 mg·株−1可以显著提高细枝木麻黄的根系活力，根系活力高表明Frankia菌从一定程度上降低了重金属Pb对根系生长发育的抑制作用。
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（1）接种Frankia湿菌体量由10 mg·株−1增加到20 mg·株−1时，细枝木麻黄结瘤量也增加，结瘤率都可达100%。
（2）从幼苗细枝木麻黄枝条的Pb含量来看，接种Frankia可以降低细致木麻黄枝条内Pb与K的含量，显著地增加了Cu的含量，但对其他矿质元素的影响并不显著。今后可以适当的增加Frankia菌的接种量，进一步探究Frankia菌接种量与细枝木麻黄矿质元素吸收之间的关系。
（3）在同一Pb胁迫浓度下，接种量为20 mg·株−1时，细枝木麻黄生长良好，Frankia菌可以有效的缓解细枝木麻黄对土壤高浓度Pb毒害的响应，在防治土壤Pb污染上具有很大的潜力和价值。
Response of Frankia and Casuarina cunninghamiana Symbiotic System to Soil Pb Pollution
doi: 10.12172/202105140002
- Received Date: 2021-05-19
- Available Online: 2022-01-14
- Publish Date: 2022-03-02
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Key words:
- Frankia bacteria /
- Casuarina cunninghamiana /
- Pb stress /
- Mineral content
Abstract: In order to explore the response of Frankia bacteria and Casuarina cunninghamiana symbiont to soil Pb pollution in soil, pot experiments were conducted to study the effects of Frankia wet bacteria 0 (CK), 10, 20 mg·plant−1 on nodulation amount, contents of Pb, K, CA, Mg, Cu, Mn in the aboveground parts, stress physiology and root activity of Casuarina cunninghamiana under certain Pb treatment. The results of the pre-experiment showed that Casuarina cunninghamiana was stressed but not lethal under 600 mg·kg−1 lead (PB), so the Pb concentration was set at 600 mg·kg−1 in the formal experiment. The results showed that the application of 20 mg·plant−1 Frankia wet mycelium could significantly increase the nodulation rate of Casuarina cunninghamiana. The nodulation rate of Casuarina cunninghamiana was 100% when inoculated with 10 mg·plant−1 or 20 mg·plant−1 Frankia wet mycelium. Compared with CK, the Pb content in aerial parts of Casuarina cunninghamiana decreased significantly with the application of Frankia wet mycelium 10 and 20 mg·plant−1. When the inoculation amount was 10 mg·plant−1, the K content in aerial parts of Casuarina cunninghamiana decreased significantly, while the Cu content increased significantly. The change of Ca, Mg and Mn was not significant (P < 0.05). The free proline and soluble sugar in Casuarina cunninghamiana decreased by 56.04% and 10.10% respectively, and the TTC reduction intensity of root activity increased by 87.12% when Frankia inoculation was 20 mg·plant−1. In conclusion, under the same Pb stress, high inoculation amount (20 mg·plant−1) of Frankia bacteria could enhance the resistance of Casuarina cunninghamiana to Pb pollution in soil.
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