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油樟,学名Cinnamomum longipaniculatum (Gamble) N.Chao ex H.W.Li,是我国能够生产天然芳香油的特有树种,该树种于1974年由四川省林业科学院森林植物分类专家赵良能发现并命名[1]。油樟精油中含55%以上的1,8-桉叶油素,1,8-桉叶油素应用面广,需求量大,但从香料植物油樟中提取收原材料资源限制,其产量有限。因此,探索一种使用油樟内生细菌通过发酵工程直接生产1,8-桉叶油素的生产工艺具有较广阔的研究空间。本文在前期筛选出高产1,8-桉叶油素油樟内生细菌的基础上[2,3],对发酵条件优化做了一个较为系统的研究,优选出1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件,为发酵工程人工生产1,8-桉叶油素奠定基础。
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油樟1,8-桉叶油素内生细菌,自制。
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药物名称 生产厂家 盐酸(分析纯) 四川西陇化学试剂有限公司 氢氧化钠(分析纯) 成都市科隆化学品有限公司 次氯酸钠(分析纯) 成都长联化工试剂有限公司 乙醇95%(分析纯) 成都市科隆化学品有限公司 丙三醇(分析纯) 成都长联化工试剂有限公司 无水硫酸镁(分析纯) 四川西陇化学试剂有限公司 LB琼脂成品培养基 杭州百思生物技术有限公司 LB液体成品培养基 杭州百思生物技术有限公司 细菌DNA提取试剂盒 生工生物工程(上海)有限公司 胰酪大豆胨琼脂(TSA) 杭州百思生物科技有限公司 卵磷脂-吐温80琼脂 杭州百思生物科技有限公司 二氯甲烷(色谱纯) 成都市科隆化学品有限公司 正己烷(色谱纯) 成都市科隆化学品有限公司 丙酮(色谱纯) 成都市科隆化学品有限公司 1,8-桉叶油素标准样品 香料与发酵重点实验室提供 Table 1. Pharmaceutical reagents
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仪器与设备 设备型号 生产厂家 超净工作台 SW-CJ-2FD 苏州安泰空气技术有限公司 精密鼓风干燥箱 GZX-GF101-3-BS-II 上海一恒科学仪器有限公司 生化培养箱 SPX-250-II 上海跃进医疗器械厂 多频率超声波清洗机 SB-600DTY 宁波新芝生物科技股份有限公司 恒温水浴锅 HHW21.600S 上海龙跃仪器设备有限公司 数显型圆周摇床 LYZ-211B 上海龙跃仪器设备有限公司 全自动高压蒸汽灭菌锅 MLS-3781L-PC 深圳市赛亚泰科仪器有限公司 96孔深孔PCR仪 Bio-rad S1000 伯乐生命医学(上海)有限公司 精密pH计 PHSJ-5 上海精密科学仪器有限公司 分析天平 JA2003 上海舜宇恒平科学仪器有限公司 气相色谱-质谱联用仪 Agilent7890A-5975C Agilent Technologies Table 2. Main equipments
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取15个100 mL锥形瓶,超声波清洗干净,70 ℃烘干备用。每个锥形瓶冷却至室温,分别加入40 mL LB液体培养基,封口膜覆盖、橡皮筋缠绕密封,置于高压灭菌锅设置温度121 ℃、灭菌时间20 min,灭菌结束后取出锥形瓶,置于超净工作台紫外线照射冷却至室温。设置发酵时间为五个梯度水平,即10 h、15 h、20 h、25 h、30 h,无菌条件下接种目标菌株,置于35 ℃,140 r·min−1恒温摇床培养箱中按发酵时间梯度分别进行发酵,每一个发酵时间水平内发酵3个锥形瓶,作为平行实验。发酵完成后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵温度。
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对发酵培养转速优选的实验设计5个梯度,即转速为120 r·min−1、130 r·min−1、140 r·min−1、150 r·min−1、160 r·min−1。在筛选出的发酵时间为20 h的基础上,每个转速梯度设置3个平行。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵培养转速。
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对发酵pH值优选的实验设计5个梯度,pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1的基础上,每个pH值梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵pH值。
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对发酵温度优选的实验设计5个梯度,即29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1、发酵pH为6.5的基础上,每个温度梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵温度。
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本试验数据用Excel 2016软件和SPSS软件进行分析。