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Volume 42 Issue 5
Sep.  2021
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Wang X, Wei Q, Mo K L. Optimization of fermentation conditions of endophytic bacteria with high yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2021, 42(5): 69−72 doi: 10.12172/202102040003
Citation: Wang X, Wei Q, Mo K L. Optimization of fermentation conditions of endophytic bacteria with high yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum[J]. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology, 2021, 42(5): 69−72 doi: 10.12172/202102040003

Optimization of Fermentation Conditions of Endophytic Bacteria with High Yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum


doi: 10.12172/202102040003
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  • Corresponding author: 249300824@qq.com(WEI Qin); mokailin@126.com(MO Kailin)
  • Received Date: 2021-02-04
    Available Online: 2021-07-15
  • Publish Date: 2021-09-30
  • In this paper, the single factor experiment was designed to optimize the fermentation conditions in order to improve the 1,8-cineole yield of the target strain. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows: fermentation temperature was 31 ℃, fermentation speed (dissolved oxygen) was 150 r·min−1, fermentation pH was 6.5 and fermentation time was 20 h. The yield increased from 2.30 mg·L−1 (without optimization) to 9.68 mg·L−1, with an increase rate of 320.8%, which had a good application prospect.
  • 加载中
  • [1] 尹礼国,凌跃,杜永华,等. 宜宾油樟营养器官精油主成分分析[J]. 江苏农业科学,2014,42(11):348−350+355.
    [2] 周万海,杨立艳,李苗,等. 天然香料植物油樟叶可培养内生细菌群落结构与多样性[J]. 食品与发酵工业,2019,45(20):43−51.
    [3] 黄金凤,王鑫,梁玉娟,等. 油樟内生细菌分离及α-松油醇高产菌株的筛选与诱变[J]. 食品与发酵工业,2020,46(1):75−81.
  • 加载中
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Optimization of Fermentation Conditions of Endophytic Bacteria with High Yield of 1,8-cineole from Cinnamomum longipaniculatum

doi: 10.12172/202102040003
  • 1. Yibin University, Yibin 644000, China
  • 2. Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, China
  • Corresponding author: 249300824@qq.com(WEI Qin);  mokailin@126.com(MO Kailin)

Abstract: In this paper, the single factor experiment was designed to optimize the fermentation conditions in order to improve the 1,8-cineole yield of the target strain. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows: fermentation temperature was 31 ℃, fermentation speed (dissolved oxygen) was 150 r·min−1, fermentation pH was 6.5 and fermentation time was 20 h. The yield increased from 2.30 mg·L−1 (without optimization) to 9.68 mg·L−1, with an increase rate of 320.8%, which had a good application prospect.

  • 油樟,学名Cinnamomum longipaniculatum (Gamble) N.Chao ex H.W.Li,是我国能够生产天然芳香油的特有树种,该树种于1974年由四川省林业科学院森林植物分类专家赵良能发现并命名[1]。油樟精油中含55%以上的1,8-桉叶油素,1,8-桉叶油素应用面广,需求量大,但从香料植物油樟中提取收原材料资源限制,其产量有限。因此,探索一种使用油樟内生细菌通过发酵工程直接生产1,8-桉叶油素的生产工艺具有较广阔的研究空间。本文在前期筛选出高产1,8-桉叶油素油樟内生细菌的基础上[2,3],对发酵条件优化做了一个较为系统的研究,优选出1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件,为发酵工程人工生产1,8-桉叶油素奠定基础。

1.   材料和方法
  • 油樟1,8-桉叶油素内生细菌,自制。

  • 药物名称生产厂家
    盐酸(分析纯)四川西陇化学试剂有限公司
    氢氧化钠(分析纯)成都市科隆化学品有限公司
    次氯酸钠(分析纯)成都长联化工试剂有限公司
    乙醇95%(分析纯)成都市科隆化学品有限公司
    丙三醇(分析纯)成都长联化工试剂有限公司
    无水硫酸镁(分析纯)四川西陇化学试剂有限公司
    LB琼脂成品培养基杭州百思生物技术有限公司
    LB液体成品培养基杭州百思生物技术有限公司
    细菌DNA提取试剂盒生工生物工程(上海)有限公司
    胰酪大豆胨琼脂(TSA)杭州百思生物科技有限公司
    卵磷脂-吐温80琼脂杭州百思生物科技有限公司
    二氯甲烷(色谱纯)成都市科隆化学品有限公司
    正己烷(色谱纯)成都市科隆化学品有限公司
    丙酮(色谱纯)成都市科隆化学品有限公司
    1,8-桉叶油素标准样品香料与发酵重点实验室提供

    Table 1.  Pharmaceutical reagents

  • 仪器与设备设备型号生产厂家
    超净工作台SW-CJ-2FD苏州安泰空气技术有限公司
    精密鼓风干燥箱GZX-GF101-3-BS-II上海一恒科学仪器有限公司
    生化培养箱SPX-250-II上海跃进医疗器械厂
    多频率超声波清洗机SB-600DTY宁波新芝生物科技股份有限公司
    恒温水浴锅HHW21.600S上海龙跃仪器设备有限公司
    数显型圆周摇床LYZ-211B上海龙跃仪器设备有限公司
    全自动高压蒸汽灭菌锅MLS-3781L-PC深圳市赛亚泰科仪器有限公司
    96孔深孔PCR仪Bio-rad S1000伯乐生命医学(上海)有限公司
    精密pH计PHSJ-5上海精密科学仪器有限公司
    分析天平JA2003上海舜宇恒平科学仪器有限公司
    气相色谱-质谱联用仪Agilent7890A-5975CAgilent Technologies

    Table 2.  Main equipments

  • 取15个100 mL锥形瓶,超声波清洗干净,70 ℃烘干备用。每个锥形瓶冷却至室温,分别加入40 mL LB液体培养基,封口膜覆盖、橡皮筋缠绕密封,置于高压灭菌锅设置温度121 ℃、灭菌时间20 min,灭菌结束后取出锥形瓶,置于超净工作台紫外线照射冷却至室温。设置发酵时间为五个梯度水平,即10 h、15 h、20 h、25 h、30 h,无菌条件下接种目标菌株,置于35 ℃,140 r·min−1恒温摇床培养箱中按发酵时间梯度分别进行发酵,每一个发酵时间水平内发酵3个锥形瓶,作为平行实验。发酵完成后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵温度。

  • 对发酵培养转速优选的实验设计5个梯度,即转速为120 r·min−1、130 r·min−1、140 r·min−1、150 r·min−1、160 r·min−1。在筛选出的发酵时间为20 h的基础上,每个转速梯度设置3个平行。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵培养转速。

  • 对发酵pH值优选的实验设计5个梯度,pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1的基础上,每个pH值梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵pH值。

  • 对发酵温度优选的实验设计5个梯度,即29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1、发酵pH为6.5的基础上,每个温度梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量,优选出最适宜的发酵温度。

  • 本试验数据用Excel 2016软件和SPSS软件进行分析。

2.   结果与分析
  • 以不同的发酵时间为基础进行的发酵时间优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(a)所示。以5个梯度水平的发酵时间对目标菌株进行发酵时间优化,随着发酵时间增加,产量由最开始的10 h时1.80 mg·L−1开始呈现稳定上升趋势,在发酵时间为20 h时,1,8-桉叶油素产量达到最高为2.67 mg·L−1,发酵时间继续延长,当超过20 h后,其产量显著降低。因此发酵时间过短或者过长,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵时间确定为20 h最为适宜。

    Figure 1.  Effect of fermentation conditions on yield

  • 以不同的发酵培养转速为基础进行的发酵转速优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(b)所示。以5个梯度水平的发酵培养转速对目标菌株进行发酵条件优化,随着发酵培养转速增加,产量由最低的120 r·min−1时1.08 mg·L−1开始呈现稳定上升趋势,在150 r·min−1时达到最高产量3.08 mg·L−1,当发酵培养转速超过150 r·min−1后,产量显著降低。因此发酵培养转速过低或者过高,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵培养转速确定为150 r·min−1最为适宜。

  • 以不同的发酵pH值为基础进行的发酵pH值优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(c)所示。以5个梯度水平的发酵pH值对目标菌株进行发酵条件优化,随着发酵pH值增加,产量由初始的pH值=6.0时2.00 mg·L−1呈现上升趋势,在pH值=6.5时达到最高产量6.53 mg·L−1,当发酵pH值超过6.5后,产量显著降低并趋于稳定。因此发酵pH值过低或者过高,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵pH值确定为6.5最为适宜。

  • 以不同的发酵温度为基础进行的发酵温度优化实验,所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1(d)所示。以5个梯度水平的发酵温度对目标菌株进行发酵条件优化,随着发酵温度增加,产量由初始的温度29 ℃时5.26 mg·L−1呈现为上升趋势,在31 ℃时达到最高产量9.68 mg·L−1,当发酵温度超过31 ℃后,产量显著降低并趋于稳定。因此发酵温度过低或者过高,都会影响1,8-桉叶油素的产量,发酵温度确定为31 ℃最为适宜。

3.   结论
  • 本研究通过单因素优化实验,确定了油樟1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件工艺参数为:发酵温度为31 ℃、发酵转速(溶氧)为150 r·min−1、发酵为pH值6.5、发酵时间为20 h。在单因素优化实验筛选出的最佳发酵条件下,产量由未优化时的2.30 mg·L−1增长至9.68 mg·L−1,产量增长率为320.8%。

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