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手参(Gymnadenia conopsea)藏药名为旺拉,又名佛手参、手掌参等。据《藏药标准》记载,手参味甘,性平,具有补益气血、生津止渴、收敛止血、壮阳等功效,常用于治疗身体虚弱、脾虚咳嗽、久泻止血、阳痿等疾病[1]。现代药理研究发现,手参具有抗过敏、延缓衰老、促进细胞增殖、免疫调节、神经保护、血管舒张等诸多活性[2]。作为一种药食两用的植物,手参也被广泛使用于保健食品领域,具有很大的开发前景和营养价值。现代研究表明,手参药材主要含有苷类、菲类、二氢芪类、芳香族类化合物,如天麻素、Dactylorhin、Militarine[3-4]。此外,还含有酚酸类、醚类、醛类和甾醇类等成分[5]。目前,已有文献采用色谱技术测定了手参中对羟基苯甲醇和天麻素类成分的含量[6-7]。然而,没有对多类成分同时进行检测分析的研究报道,这显然不符合中药多成分、多靶点的整体性特点。因此,本研究首次采用体现整体性的氢核磁共振(1H-NMR)代谢组学技术,同时检测分析其初生和次生代谢产物,建立整体1H-NMR指纹图谱,结合PCA化学计量学方法,从代谢物组水平上系统分析了不同产地手参药材的初生和次生代谢产物差异,从而对不同产地手参药材的质量进行整体评价,以期筛选出优质手参的产地,为手参药材的人工种植、品种选育、质量控制和开发利用提供参考依据。
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布鲁克Bruker700MHz核磁共振波谱仪;KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);W201型恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司);Sartorius BP221S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
氘代甲醇(CD3OD,99.8%)和重水(D2O,99.9%)均购自四川赛因斯特生物科技有限公司;3-(三甲基硅基)-2,2,3,3-四氘代丙酸钠盐(TSP)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA);分析级磷酸二氢钾(KH2PO4)购自成都市科龙化工试剂厂;天麻素(批号:DST191013-013)、Dactylorhin(批号:DST200901-233)、对羟基苯甲醇(批号:DST191016-123)、对羟基苯甲醛(批号:DST200513-129)、Militarine(批号:DST200622-025)对照品均购自成都德斯特生物技术有限公司,纯度均大于98%。
2019年8月,共收集了16批来自四川省甘孜州不同产地的手参药材,鉴定结果均为兰科植物手参Gymnadenia conopsea。采集后先除去泥土杂质,及时放在日光下晒干,分别置于干燥阴凉处保藏,选取手参干燥块茎作为试验样品,样品信息见表1。
编号 来源 海拔/m 东经 北纬 GC-1 色达县泥朵镇棒须村 4 143 99°46′5.59″ 32°37′11.49″ GC-2 色达县大则乡汪扎村 4 020 100°7′53.43″ 32°16′14.02″ GC-3 泸定县燕子沟镇燕子沟 2 344 102°2′0.31″ 29°41′44.50″ GC-4 泸定县燕子沟镇雅加埂 3 229 102°2′33.60″ 29°47′45.57″ GC-5 理塘县濯桑乡业务村 3 792 100°20′10.95″ 29°43′13.97″ GC-6 理塘县奔戈乡卡灰村 3 893 100°18′0.25″ 29°54′23.91″ GC-7 新龙县甲拉西乡依西村 3 580 100°19′16.03″ 30°53′42.09″ GC-8 新龙县拉日马镇泽龙多村 3 973 100°37′21.43″ 30°52′7.49″ GC-9 炉霍县仁达乡格色村 3 456 100°43′5.03″ 31°10′16.81″ GC-10 乡城县香巴拉镇冷龙村山 4 040 99°45′9.12″ 28°57′17.87″ GC-11 德格县窝公乡拉绒村 4 301 99°2′15.08″ 32°1′30.58″ GC-12 石渠县长沙贡马乡查拉村 4 233 97°58′7.99″ 33°26′1.96″ GC-13 甘孜县查龙镇查龙一村 3 853 99°44′13.35″ 32°12′52.49″ GC-14 甘孜县茶扎乡银多村 4 229 99°42′38.73″ 32°1′43.65″ GC-15 康定市塔公镇下马龙村 3 806 101°34′2.45″ 30°18′33.95″ GC-16 道孚县八美镇河垭村 3 507 101°29′15.87″ 30°30′18.58″ Table 1. Origins of Gymnadenia conopsea from different regions
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以氘代甲醇为频率内锁,测定条件如下:观察频率700.20 MHz,测定温度T = 25 ℃,采样次数Number of Scans = 64,脉冲延迟时间Relaxation Delay = 4.0 s,谱宽Spectral Width = 11 363.6 Hz,采样时间Acquisition Time = 1.4418 s,脉冲宽度Pulse Width = 10.87 μs,采用标准的预饱和脉冲序列(ZGPR)压制水峰信号。
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主要采用“加标准品定性试验”及对比文献数据进行信号归属,将测得的1H-NMR自由感应衰减信号导入MestReNova (version 7.0)软件进行傅立叶转换,并手动调整相位和基线,以TSP(0 mg·L–1)为基准校正化学位移[8]。针对0.50~9.80 mg·L–1范围的图谱以0.002 mg·L–1为化学位移值单位进行分段积分(binning),然后以总峰面积进行归一化处理,再以ASCII格式输出数据,得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值,最后将获得的数据矩阵导入SIMCA-P软件(version 11.5),数据采用Center方法进行尺度同一化处理,预处理后的数据再进行主成分分析(PCA),以评价不同产地手参药材的质量差异。