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土壤是地球上大多数生物生存和发展的基础载体,是地球表层系统中生物多样性最丰富的生命层。土壤微生物作为土壤生态系统中最为活跃的一部分,是参与生物地球化学循环的重要动力,对维持土壤生态系统稳定性、生态修复等具有一定作用[1-3]。细菌是土壤中数量最多、分布最广泛的微生物类群,在土壤生态过程中发挥重要的作用;真菌不仅与植物共生,也是有机物的重要分解者之一[3-5]。二者均是表征环境变化的敏感指标,常用于预测土壤养分和环境质量的变化[6]。大量研究证明土地利用方式是影响土壤微生物生物量及群落结构的重要因子[7-8]。目前国内外学者在微生物物种及结构多样性[9-11]、功能多样性[12-13]、与环境因子关联性方面研究较多[14-15],多为同区域单一土地利用类型[11,13,15]或同区域少数土地利用类型的对比[9,16],但欠缺对宏观区域内多种土地利用方式的研究[17]。
本研究基于Illumina MiSeq高通量测序平台,对取自彭州市5种典型土地利用方式的土壤细菌和真菌多样性及群落结构进行了探究,试图探索土壤微生物在不同利用方式及土壤理化性质下的群落结构特征,提出土地利用结构优化措施,为探索可持续的土地利用方式提供理论依据。
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彭州市(103°10′—104°40′E,30°54′—31°29′N)位于四川省成都市西北部,地处成都平原与龙门山过渡地带,属中亚热带季风性湿润气候,气候温和,四季分明。年平均气温15.6 ℃,全年无霜期276 d,年平均降水量932.5 mm。地貌以山地、平原为主,土壤为砂岩发育而成的山地黄壤。地带性森林植被类型为常绿阔叶林。
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2019年10月,分别在城市绿地(Urban Greenland,UL)、农业用地(Farmland,FL)、人工林地(Plantation Woodland,PL)、滩涂地(Tidal Wetland,TL)、撂荒地(Abandoned Farmland,AL)生境下设置3个重复样地,共15个固定样地。样地分布见图1,生境概况见表1。取土前除去土壤表面的覆盖物,用内径为5 cm的取样器以“五梅花”形采集0~10 cm土壤样品,去掉植物根系、石砾等杂物后充分混匀,用无菌袋盛装并置于便携式保鲜箱内保存。将采集的土样带回实验室,过2 mm筛后,一部分保存于−80 ℃的冰箱用于分子生物学研究,一部分于干燥常温环境保存用于土壤理化性质的测定。
利用方式 利用年限/年 主要植被 海拔/m 样地描述 UL 15 天竺桂,美人蕉,酢浆草等Cinnamomum japonicum,
Canna indica, Oxalis corniculata, etc.500~600 凋落物层厚约1 cm,
中度干扰FL 5~12 白菜,牡丹,葱Brassica chinensis, Allium fistulosum,
Paeonia suffruticosa500~700 无凋落物,施药、施肥、
翻耕,重度干扰PL 20 杉木,华西箭竹Cunninghamia lanceolata, Fargesia nitida 1000~1500 凋落物层厚约2~3 cm,
轻度干扰TL 30 芭茅,荻,芦苇Miscanthus floridulus, Triarrhena sacchariflora,
Phragmites australis500~800 无凋落物,轻度干扰 AL >5 白三叶,牛筋草,马唐等Trifolium repens, Eleusine indica, Digitaria sanguinalis, etc. 800~900 无凋落物,轻度干扰 Table 1. Basic characteristics of different land use types
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按照常规土壤农化分析方法[18]测定土壤基本理化性质,见表2。土壤容重(Bulk density,Bd)采用环刀法测定,土壤pH值(1:2.5)采用酸度计电位法,土壤含水率(Water content,Wc)采用烘干法测定。土壤铵态氮(Ammonium nitrogen,NH4+-N)、速效磷(Available Phosphorus,AP)和速效钾(Available Potassium,AK)用BSL-2C2土壤养分速测仪测定。
土地利用方式 土壤理化指标 含水率/% 容重/(g·cm−3) 酸碱度 铵态氮/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) UL 17.28±1.05c 1.89±0.26a 5.42±0.03c 29.85±1.88c 139.93±22.28c 58.19±3.39ab FL 17.57±1.11c 1.84±0.04ab 5.68±0.26b 37.85±0.87b 130.67±21.94c 50.15±4.98b PL 30.84±2.06a 1.52±0.19c 5.31±0.04c 53.95±1.31a 278.37±11.30a 68.10±12.71a TL 20.33±0.67bc 1.75±0.12abc 5.83±0.07b 7.93±0.81d 117.73±12.07c 36.63±4.69c AL 23.41±3.26b 1.55±0.09bc 6.45±0.09a 38.84±0.56b 201.93±2.99b 54.52±1.54b 注:不同字母表示同列间差异显著(P<0.05)。下同。 Table 2. Physical and chemical characteristics of soil under different land use types
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采用MP-bio 公司的Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒提取土壤微生物基因组总DNA,用引物338F 和806R 扩增土壤细菌16S rRNA基因的V3-V4区,用引物ITS1F 和ITS2R 扩增土壤真菌18S rRNA基因的ITS1区,基于Illumina MiSeq 测序平台进行高通量测序。测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。
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用Excel2013处理基础数据,SPSS24.0进行分析,GraphPad Prism5进行制图。利用Mothur软件计算土壤微生物的Shannon指数[19]、Simpson指数[20]、ACE指数[21]和Chao1指数[22]进行多样性分析。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan新复极差法进行差异显著性检验(ɑ=0.05),分析得出不同生境土壤理化性质、微生物多样性及群落结构的差异。对土壤微生物多样性指数和土壤理化性质进行Pearson相关性分析,并采用冗余分析法(RDA)探明微生物群落对环境因子的响应机制。
1.1. 研究区概况
1.2. 研究方法
1.2.1. 样地设置与样品采集
1.2.2. 土壤理化指标测定
1.2.3. 土壤微生物区系测定
1.3. 数据分析
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如图2A,各生境土壤在门水平上的主要菌群如下:变形菌门(Proteobacteria,31.19%)、放线菌门(Actinobacteria,22.08%)、酸杆菌门(Acidobacteria,15.99%)、绿弯菌门(Chloroflexi,12.77%)、己科河菌门(Rokubacteria,3.6%)。其中,前4个菌门的相对丰度均大于10%,约占所有细菌的82%,是细菌中的优势菌门。由图2A可知,变形菌相对丰度在农业用地生境中最低(P<0.05);且在滩涂地和撂荒地间存在显著差异(P<0.05),但分别与城市绿地和人工林地无显著差异。放线菌在城市绿地最高(P<0.05),农业用地次之(P<0.05),人工林地最低(P<0.05),但滩涂地与撂荒地无显著差异。绿弯菌在农业用地生境中最高(P<0.05),滩涂地显著高于城市绿地和人工林地(P<0.05),其余无显著差异。酸杆菌在城市绿地和人工林地间差异显著(P<0.05),其余不存在显著差异。己科河菌在人工林地生境中最高(P<0.05),滩涂地与农业用地、撂荒地差异显著(P<0.05),但其他无显著差异。
如图2B,各生境土壤在目水平上的主要菌群如下:根瘤菌目(Rhizobiales,10.32%)、Subgroup_6菌目(8.15%)、β-变形菌目(Betaproteobacteriales,5.95%)、Gaiellales(4.74%)、Rokubacteriales菌目(3.56%)。由图2B可知,除Subgroup_6菌外,其他4种细菌目在各生境下均有显著差异。根瘤菌在农业用地中最低(P<0.05),但人工林地与滩涂地,城市绿地与撂荒地间无显著差异。β-变形菌在农业用地生境中最低(P<0.05),但与人工林地无显著差异;城市绿地与撂荒地存在显著差异(P<0.05),其余无显著差异。Gaiellales在农业用地中分布较多(P<0.05),但与城市绿地无显著差异;在滩涂地最低(P<0.05),其余差异不显著。Rokubacteriales在人工林地最高、滩涂地最低(P<0.05),而城市绿地、农业用地和撂荒地间无显著差异。
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对15个样地的土壤样品所得测序序列,以97%相似性阈值进行OTU聚类,共检测到细菌群落7422个OTU,分属37门106纲278目491科959属2137种,15个样地的细菌群落多样性见表3。由表3可知,人工林地土壤细菌群落的Shannon指数、Simpson指数、Ace指数、Chao1指数均与其他4种生境存在显著差异(P<0.05)。其中,Shannon指数为最低值,Simpson指数为最大值,表明人工林地土壤的细菌群落多样性最低。Ace指数和Chao1指数常用来估计物种总数,两者均与群落丰富度呈正比。人工林地土壤的Ace指数和Chao1指数均为最低值(见表3),表明人工林地土壤的细菌群落丰富度最低。滩涂地、撂荒地和城市绿地的多样性与丰富度均较高。综上,各生境下的土壤细菌群落多样性与丰富度排序基本一致,表现为人工林地<农业用地<撂荒地<滩涂地<城市绿地。
土地利用方式 多样性指数 香浓指数 优势度指数 艾斯指数 丰富度指数 UL 6.94±0.09a 0.002±0.0001c 4170.11±236.00a 4193.21±206.24a FL 6.85±0.05a 0.003±0.0003b 3986.77±119.65a 3996.64±102.24a PL 6.41±0.20b 0.005±0.0009a 3275.55±385.42b 3273.39±388.81b TL 7.02±0.05a 0.002±0.0002c 4225.35±158.55a 4180.61±170.92a AL 6.99±0.03a 0.002±0.0001c 4196.60±208.03a 4176.91±202.59a Table 3. Diversity analysis of soil bacterial community under different land use types
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如图3A,各生境土壤在门水平上的主要菌群如下:子囊菌门(Ascomycota,59.45%)、担子菌门(Basidiomycota,15.61%)、被孢霉门(Mortierellomycota,15.24%)、未知菌门(unclassified_k_Fungi,7.86%)、隐真菌门(Rozellomycota,1.44%)。其中,优势真菌门是子囊菌门、担子菌门和被孢霉门,约占所有真菌的90%。由图3A可知,子囊菌和担子菌的相对丰度在各生境分布无显著差异,而被孢霉菌在农业用地生境的相对丰度显著高于其他生境(P<0.05),同时,其相对丰度在城市绿地与撂荒地间有显著差异。未知菌门在人工林地与滩涂地生境中的相对丰度差异不显著,但均高于其他生境(P<0.05)。隐真菌在人工林地生境中分布较多,显著高于其他生境(P<0.05),而其他4种生境无显著差异。
如图3B,各生境土壤在目水平上的主要菌群如下:子囊菌门下目(unclassified_p_Ascomycota,16.00%)、被孢霉目(Mortierellales,15.21%)、肉座菌目(Hypocreales,14.97%)、未知菌目(unclassified_k_Fungi,7.86%)、丝孢酵母目(Trichosporonales,6.36%)。其中,优势真菌目是未分类子囊菌门下目、被孢霉目和肉座菌目,约占所有真菌目的46.18%。由图3B可知,除肉座菌外,其他4种菌群在各生境分布均有显著差异。未知子囊菌门下目的相对丰度在人工林地、滩涂地与撂荒地3种生境间无显著差异,但均显著高于农业用地(P<0.05),且农业用地与城市绿地有显著差异(P<0.05)。被孢霉菌在农业用地生境中分布较多,远高于其他生境(P<0.05),同时城市绿地与撂荒地存在显著差异(P<0.05)。未知菌目在人工林地与滩涂地间无显著差异,但均高于其他3种生境(P<0.05)。丝孢酵母目相对丰度在撂荒地最高(P<0.05),而在其他4种生境中分布较少。
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对15个样地的土壤样品所得测序序列,以97%相似性阈值进行OTU聚类,共检测到真菌群落5360个OTU,分属17门46纲118目295科627属1033种,15个样地的真菌群落多样性见表4。由表4可知,5种生境的土壤真菌群落多样性指数均存在显著差异。Shannon指数和Simpson指数在城市绿地与农业用地间均存在显著差异(P<0.05),同时Shannon指数在人工林地与撂荒地间存在显著差异(P<0.05),其余差异不显著。ACE和Chao1指数均表示丰富度,可知农业用地的丰富度指数显著低于其他生境(P<0.05),滩涂地最高(P<0.05),但与人工林地无显著差异,同时城市绿地与人工林地、撂荒地差异不显著。综上,各生境下的土壤真菌群落多样性表现为撂荒地<农业用地<滩涂地<人工林地<城市绿地,丰富度表现为农业用地<撂荒地<城市绿地<人工林地<滩涂地。虽各生境下的菌群多样性与丰富度存在一定差异,但可以得知人工林地真菌群落多样性和丰富度均较高,而农业用地和撂荒地均较低。
土地利用方式 多样性指数 香浓指数 优势度指数 艾斯指数 丰富度指数 UL 4.63±0.07a 0.03±0.01b 1042.96±57.24b 1049.03±65.87ab FL 3.35±0.56bc 0.16±0.08a 593.63±239.69c 595.69±241.37c PL 4.39±0.98ab 0.08±0.08ab 1173.02±112.61ab 1172.26±117.55ab TL 3.74±0.53abc 0.14±0.09ab 1315.06±101.47a 1303.93±115.27a AL 2.92±0.15c 0.18±0.03a 1020.25±121.28b 1017.02±120.38b Table 4. Diversity analysis of soil fungal community under different land use types
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土壤微生物多样性与土壤环境因子的相关性分析表明,除Bd以外的各理化性质均与细菌多样性有显著差异,且均与Shannon指数存在极显著相关性(P<0.01),而真菌多样性仅与pH存在显著相关性(见表5)。Wc和AK均与细菌多样性呈极显著相关(P<0.01),其中,与Simpson指数呈正相关,与Shannon指数和丰富度指数呈负相关。由表5可知,Wc、NH4+-N和AK是影响细菌群落多样性和丰富度的关键性环境因素;pH是影响真菌群落多样性的唯一环境因子,而各环境因子与丰富度指数的相关性均不强。
为揭示微生物群落与环境因子的关系,以门分类水平上的微生物群落作为响应变量,土壤理化因子作为环境解释变量进行了冗余分析(RDA)。可知影响细菌菌群组成的主要环境因子是pH、Wc、AK、Bd,而对真菌菌群影响较大的是pH、Bd(见图4)。如图4A,人工林地生境的己科河菌与AK、Wc、AP及NH4+-N均有显著的正相关性,与Bd和pH呈负相关。撂荒地生境中除己科河菌之外的4种优势菌群均与pH呈正相关,变形菌与pH的相关性最强。农业用地与除Bd以外的环境因子均呈负相关,而与Bd有一定正相关性。城市绿地的放线菌和绿弯菌与pH和Bd存在一定正相关。如图4B,城市绿地、人工林地、滩涂地生境的子囊菌与pH、Wc和AK有一定正相关性,而与AP、NH4+-N呈负相关。农业用地生境的被孢霉菌与NH4+-N呈正相关,与AK、Wc和pH负正相关。撂荒地生境的担子菌与pH存在较强的正相关,且与Wc和AK有一定正相关性,但与Bd呈负相关。
多样性指数 土壤环境因子 含水率 容重 酸碱度 铵态氮 速效钾 速效磷 细菌 香浓指数 −0.754** 0.477 0.526** −0.727** −0.753** −0.602** 优势度指数 0.732** −0.452 −0.522* 0.708** 0.724** 0.569* 丰富度指数 −0.730** 0.512 0.436 −0.631* −0.723** −0.490 真菌 香浓指数 0.038 0.311 −0.643** 0.067 0.134 0.416 优势度指数 0.008 −0.297 0.523* −0.099 −0.143 −0.416 丰富度指数 0.306 −0.186 −0.046 −0.311 0.225 −0.093 注:*表示在P<0.05水平下相关性达到显著;**表示在 P<0.01水平下相关性达到极显著(双尾)。
Note: *Correlation is significant at P<0.05 level (2-tailed); ** Correlation is significant at P<0.01 level (2-tailed).Table 5. Correlation analysis between soil microbial diversity and environmental factors