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薇甘菊(Mikania micrantha)为菊科藤本植物,通过攀缘并形成厚毯状枝叶层覆盖宿主植物,使宿主植物不能进行正常光合作用而衰亡。在2002年被列入中国首批外来入侵物种名录,目前主要通过人工铲除和化学除草剂处理,成本高,效率低下,控制时间短,除草剂对宿主植物造成伤害且污染环境,控制效果差。
据国外报道,薇甘菊柄锈菌具有生防潜力[1],国内有关引进柄锈菌利用文献报道不少,也取得了较好的效果,但未推广应用,且外来物种的入侵风险仍难以消除[2-4],程伟文报道了豆荚大茎点霉对薇甘菊的生防潜力,但仍处于试验阶段[5]。
在薇甘菊为害区域调查发现,其叶片上有一种叶斑病,侵染叶片造成叶斑及叶枯,偶发侵染茎干造成枝枯,发生严重时,薇甘菊生长明显衰退,具备作为以菌防草研究的可能。本研究通过对薇甘菊叶斑病病原菌进行分离培养、纯化、致病性测定、病原鉴定、生物学特性和寄主范围测定的研究,旨在明确病原菌,探究病原菌培养特性及对本地主栽农作物、水果、经济作物安全性,从而为该菌的利用提供初步参考。
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薇甘菊叶斑病能入侵薇甘菊,使叶片、叶柄及未老化茎产生病变,初期为黄褐色点状病斑(见图1A),后逐渐扩大,近圆形或沿叶脉、侧脉扩展成不规则形病斑,病斑中央植物组织易失去水分而干枯、变薄、易裂、穿孔(见图1B和C)。叶柄及枝条的病斑初期为褐色小点、略凹陷,后期不断扩大呈长条形褐色病斑,直至环绕枝条一圈。病叶保湿情况下,肉眼或用放大镜观察未见小黑点等其他病症。
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分离纯化菌株回接只有1个致病,其余菌株和对照不发病。接种后第3天症状开始出现(见图2A),发病初期接种点呈黑色坏死,病健交界明显,随后病斑继续扩展,初期发病部位组织坏死分解(见图2B),将该菌菌落活体接种至薇甘菊无菌苗,表现为叶片及茎段发病,与田间观察到的症状相似(见图2C)。
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培养性状及形态在PDA上菌落圆形,边缘未老熟菌丝白色,老熟后菌丝呈黄色,菌落整体颜色初期白色后变黄褐色至深褐色(见图3A)。在PDA上不产孢,将菌丝接种于薇甘菊无菌苗可产生分生孢子器和分生孢子。
分生孢子器黑色、扁球形至球形(见图3 C和D),直径60.2~185.3 μm×72.8~159.2 μm,分生孢子椭圆形到卵圆形,无色,单胞,顶端钝圆(见图3 B),分生孢子大小:3.9~7.1 μm×1.3~3.2 μm。
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通过ITS对引物对菌株进行PCR扩增、测序,得到长度分别为516 bp的序列。将得到的序列在GenBank中进行比对,并构建系统发育树,经MEGA7.0软件进行系统发育分析,系统发育树的各个分支的支持强度通过1 000次重复的自展检验数值进行评估。结果发现,菌株(WGJ)与Boeremia exigua聚为一个进化枝(见图4),支持率为100%。依据形态鉴定和系统发育分析,叶斑病病原菌经鉴定为Boeremia exigua。
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试验结果看出,15~27 ℃范围内,该病原菌菌落直径随温度升高逐渐增大;27~42 ℃范围内,菌落直径随温度升高逐渐减小。菌丝生长适宜温度为24~33 ℃,最适温度27 ℃,42 ℃时菌丝不能生长,菌落直径与接入菌饼直径相同(见图5)。
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经菌丝段悬浮液喷雾接种,除桑树出现少量病斑,其余参试作物均未出现被侵染症状(见表1)。
物种 学名 发病 致死 再侵染 水稻 Oryza sativa L. − − − 木薯 Manihot esculenta Crantz − − − 香蕉 Musa nana Lour. − − − 龙眼 Dimocarpus longan Lour. − − − 芒果 Mangifera indica L. − − − 桉树 Eucalyptus robusta − − − 橡胶树 Hevea brasiliensis − − − 甘蔗 Saccharum officinarum − − − 桑树 Morus alba Linn. Sp. + − − 注:接种发病及再侵染程度表述,“−”表示不发病,“+”表示病斑数小于5个,平均单个病斑面积小于4 mm2,“++”表示病斑数多于5个,单个病面积小于4 mm2,病斑不连片,“+++”表示病斑数多于5个,且病斑面积大于4 mm2,或病斑连片扩展。 Table 1. Host range determination of pathogenic bacteria
由表1可知,所有参试作物,均未出现致死,仅桑树轻度发病,并未发现再侵染。