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白及[Bletilla striata (Thunb.) H.G.Reichenbach]是兰科白及属的多年生草本植物[1]，主要分布在云南、四川和贵州等地[2]，白及具有广泛的药用价值及园林价值，白及以根茎入药，具有收敛止血、消肿生肌等功效，是我国重要的中药材[3]，亦可作为盆栽室内观赏，点缀于较为荫蔽的花台、花境或庭院一角[4]。此外，白及亦是装裱书画的高品质粘合剂，并广泛应用于高档美容化妆品及保健等行业[5]。
白及属植物种间和种内遗传分化强烈[6]，本研究在白及资源调查和收集过程中，发现白及表型变异程度较大，主要表现在株型、花型、花色、花期、花量、花茎、叶片形态、托叶宿存情况及托叶大小及抗逆性等方面，花色有白色、淡粉色、粉紫色、紫色、深紫色等，开花时间主要在3—5月之间变化，叶片形态存在宽窄差异，从表型看，白及种内差异较大。
nrDNA ITS序列是位于真核生物nrDNA18S和26S之间的内含子[7]，由于进化中的选择压力小，nrDNA ITS片段在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，常用于物种鉴定和系统进化研究[8]。而在兰科植物中，Kurt[9]等指出兰科植物的ycf1（Hypothetical chloroplast openreading frame 1）基因具有高度变异性，并比matK基因更具有可靠的变异信息位点。本研究收集来源于四川和云南的30个白及单株，克隆并分析其nrDNA ITS序列和叶绿体ycf1序列的差异基因，以期为白及遗传分化研究鉴定提供理论基础。
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在四川和云南采集白及野生种和栽培种共30个样本，样本植株移栽在成都市农林科学院科研基地，试验时选择成熟个体，取无病虫害的叶片立即放在液氮中，–80 ℃保存待用（见表1）。
样品编号 取样地点 野生种/栽培种 B_1 云南普洱 栽培种 B_2 云南保山 栽培种 B_3 云南普洱 栽培种 B_4 四川都江堰虹口 野生种 B_5 四川都江堰虹口 野生种 B_6 四川大邑雾山 野生种 B_7 四川沐川 野生种 B_8 四川内江 栽培种 B_9 四川内江 栽培种 B_10 四川水磨 野生种 B_11 四川雅安 野生种 B_12 四川康定 野生种 B_13 四川彭州 栽培种 B_14 四川彭州 栽培种 B_15 云南红河 栽培种 B_16 四川内江 栽培种 B_17 四川内江 栽培种 B_18 四川水磨 野生种 B_19 四川内江 栽培种 B_20 云南普洱 栽培种 B_21 四川汶川 野生种 B_22 云南曲靖 栽培种 B_23 四川重庆 栽培种 B_24 四川水磨 野生种 B_25 四川沐川 野生种 B_26 四川内江 栽培种 B_27 四川内江 栽培种 B_28 四川内江 栽培种 B_29 四川水磨 野生种 B_30 四川彭州 栽培种 Table 1. Basic information of the tested materials
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采用植物DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取DNA，并参考吴劲松[10]文献中ITS、ycf1基因引物及相关体系进行 PCR 扩增、电泳检测、切胶回收、测序（见表2）。
基因名称 5′-3′ nrDNA ITS P1 CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC P2 TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG ycf1 F1 ACCTGAATCATTTTATGTATTGG R1 TTTGGTACCTCTTATTATCGACC Table 2. Primer sequences
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利用DNAstar软件分析ITS和ycf1序列的长度和G+C含量；运用DNAMAN 工具对ITS和ycf1序列进行多序列比对，分析序列的同源性，采用邻位连接法（Neighbor-Joining method）构建系统进化树，选择检验方法为“Bootstrap method”，重复抽样次数为1000，应用软件MEGA7.0[11]（Molecular evolution genetics analysis）分子进化遗传分析软件分析系统进化关系。
1.1. 样品采集
1.2. 总DNA提取、目的序列的 PCR 扩增与测序
1.3. 数据分析
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对30个白及样本的nrDNA ITS和叶绿体ycf1序列进行扩增，如表3所示，获得ITS序列长度为633−742 bp，GC含量为59.97%~61.64%，ycf1序列长度为864~969 bp，GC含量为27.76%~28.47%。
编号 ITS序列长度/bp GC含量/% ycf1序列长度/bp GC含量/% B_1 703 61.59 890 28.31 B_2 703 61.45 907 27.89 B_3 696 61.64 969 27.76 B_4 704 61.08 894 28.19 B_5 702 61.40 900 28.22 B_6 728 60.99 900 28.11 B_7 704 60.80 864 28.36 B_8 703 60.46 881 28.15 B_9 726 60.74 891 28.28 B_10 713 60.87 904 28.21 B_11 663 60.03 902 27.94 B_12 664 60.24 886 28.33 B_13 716 60.61 930 28.28 B_14 721 61.03 885 28.47 B_15 705 61.28 893 28.22 B_16 721 60.61 905 27.96 B_17 719 60.78 907 28.22 B_18 720 60.69 895 28.22 B_19 710 61.13 900 28.11 B_20 699 61.37 900 28.11 B_21 711 61.04 893 28.22 B_22 717 60.95 902 28.05 B_23 716 61.59 910 28.02 B_24 717 61.09 906 28.15 B_25 668 60.48 873 28.29 B_26 712 60.67 907 28.00 B_27 716 60.89 884 28.28 B_28 717 60.81 899 28.14 B_29 730 60.82 909 28.16 B_30 742 59.97 951 28.08 Table 3. Sequence length and GC content
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通过比对，确定本研究涉及材料nrDNA ITS序列和叶绿体ycf1序列存在不同程度的变异，根据ycf1基因共鉴定出5个单倍型，存在4个变异位点，B_4和B_5属于B型，B_11属于C型，B_12属于D型，B_16属于E型，其余25个样本属于A型，具体变异情况见表4。
相比较叶绿体ycf1基因，nrDNA ITS基因变异程度较大，共鉴定出11个单倍型，存在32个变异位点，其中B_1、B_2、B_3、B_6、B_15、B_23属于A型，B_4、B_5、B_14属于B型，B_7、B_16、B_17、B_18、B_25、B_26、B_27、B_28属于C型，B_8、B_9、B_10属于D型，B_19、B_20、B_21、B_29属于E型，B_11、B_12、B_13、B_22、B_24、B_30分别属于F、G、H、I、J、K型，具体变异情况见表5。
单倍型 1 2 3 4 A型 − T G C B型 − A G C C型 − T A A D型 − T A C E型 A T G C 注：“·”表示与单倍型A型核苷酸相同，“−”表示缺失或插入。 Table 4. Variation of ycf1 genes in chloroplasts
单倍型 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 A C − G T T C A C C G A A C T G G B · − · · · · · · · · · · · · · · C · − · · · · · T · · · · · · · A D · − · · · · · T · · · · · · · A E · − · · · · · · · · · · · · · · F T − A C · T G T T · G G T · A A G T − A C · T G T T · G G T · A A H T A A C · T G T T T G G T · A A I T − A C C T G T T G G T C A A J · − · · · · · T · · · · · · · K · − · · · · · · · · · · · · · · 单倍型 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 A C A C G C − T C A G − G T C T C B · · · · · − · · · T − · · · · · C · · · A · − · · · · − A · · · · D · · · A · − · · · · − · · · · · E · · · · · − · · · T − · · T · · F T · − A T − · T · · − · G · C T G T G − A T − · T · · G · G · C T H − A T − C T G C · G · C T I T · · A T − · T · · − · G · C T J · · · A · − · · · · − · · · · · K · · · · · C · · · T − · · T · · 注：“·”表示与单倍型A型核苷酸相同，“−”表示缺失或插入。 Table 5. Variation of nrDNA ITS genes
本研究中，共得到白及30条ITS序列，共鉴定出11个单倍型，表现出很高的杂合性，构建NJ树，发现30份白及材料分为3个支系，A型、B型、E型聚为一支，B_8和F、G、H、I、J、K型聚为一支，C型和D型聚为一支（见图1）。
Figure 1. Phylogenetic tree of Bletilla striata based on ITS sequence
2.1. 序列特征
2.2. 遗传多样性
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白及属植物具有较高的遗传多样性。孙宇龙[12]等通过SRAP分子标记探讨了12个白及野生居群的遗传多样性和居群遗传结构，表明白及物种有着丰富的遗传多样性，认为白及居群间存在中等水平的遗传分化。周天华[13]等构建白及SSR指纹图谱，认为白及属在种间水平均有较高的遗传多样性，物种间遗传分化强烈，物种间的基因流较弱。
本研究比较30个白及样本的ITS序列和ycf1序列，发现ycf1序列变异较小，ITS序列变异较大，种内遗传多样性丰富。相比较A型，B_12、B_13、B_13和B_22的ITS序列变异较大，分别发生了20、22、24和21个基因位点变异，此四个样本变异情况相似，且在表观上均表现出叶型狭长、花期晚的性状，根据ITS序列差异，将30份白及材料聚类为3个支系，结合白及的表观性状，发现白及ITS序列与其花期和叶型有相关性，与花型、花色等其他性状无明显相关。
种质资源是中药材遗传育种和品种选育的基础，目前，市场上流通的白及药材种质来源广泛，质量参差不齐。种源不清、种子种苗质量参差不齐，是影响白及规范化种植和白及药材质量的重要因素[14]。本研究收集白及种质资源，克隆并分析白及nrDNA ITS和叶绿体ycf1序列，为白及种质资源开发利用奠定了基础。后续将对这批白及种质资源的化学成分、抗逆性和其他品质性状进行深入研究，以期为选育产量高、抗逆性强、品质优的新品种提供材料基础。
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