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成都麻羊，又名四川铜羊，原产于成都平原及附近丘陵地区，是我国优良肉用地方山羊品种[1, 2]。成都麻羊具有生长发育快、体格较大、性早熟、繁殖能力强、屠宰率高、膻味轻、肉质嫩、板皮优良、肉皮兼用等显著特点，现有丘陵型和山地型两个生态类型[1-3]。在我国，早有引进成都麻羊改良当地山羊培育新品种的案例，如四川省有名的南江黄羊、金堂黑山羊品种[1-3]。但是，圈养规模较小、缺乏科学的管理、近亲繁殖现象等问题会导致成都麻羊的遗传变异丢失[4]，引起圈养种群退化，长期会导致遗传多样性逐渐丧失，一些特有的重要基因资源会在培育中消失殆尽，同时会造成个体适应能力变弱，抗病力差，死亡率增加等[5]，长期下来会影响圈养成都麻羊种群的健康发展。畜禽遗传资源本质上是基因资源，保护畜禽遗传资源就是保护基因的多样性[6]。因此，成都麻羊作为我国山羊品种的一个宝贵基因库，维持其种群遗传多样性，最大限度地降低遗传损失，保证其种群遗传健康，对其种群种质资源的良性发展和种群的遗传管理都具有重要意义。
微卫星DNA（microsatellite DNA），是以少数几个核苷酸为基本单位进行多次串联重复的DNA序列，因而也被称为简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）或短串联重复序列（short tandem repeat，STR）[6-9]。相比其他的分子标记技术，微卫星DNA标记优点突出，如呈现共显性遗传、高度多态性等，是目前最为准确、先进的遗传标记系统之一，是种群遗传结构研究和多样性评估最常用的工具[5, 7, 10-14]。在山羊、绵羊中，利用微卫星DNA标记测定遗传多样性已有较多相关研究[9, 11, 15-21]。
鉴于此，为了加强成都麻羊资源的保护和利用，实现优质地方山羊品种种质资源的良性开发，满足市场对成都麻羊的发展需求，借助微卫星DNA作为遗传标记，对成都麻羊圈养种群进行遗传多样性现状调查，以期为该资源群体的遗传背景研究提供分子理论依据，同时对合理利用成都麻羊资源和可持续发展也具有重要意义。
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本研究以成都西岭雪农业开发有限公司（四川省成都市大邑县）饲养的成都麻羊为研究对象，共随机挑选268只个体采集血液样品，其中雄性个体18只，雌性个体250只。对每只成都麻羊个体进行颈静脉采血5 mL，随后用EDTA抗凝混匀，置于冰盒中带回实验室，−20 ℃保存。
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本研究采用Tianamp基因组DNA提取试剂盒提取DNA，提取步骤参照使用说明书执行。将提取得到的DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并将其保存于−20 ℃冰箱。
参考已发表文献[7, 9, 10, 16, 17, 20, 21]，共选46对多态性微卫星引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通过预实验筛选，有9对引物（见表1）能较稳定地扩增得到多态性较高的微卫星位点。PCR扩增体系（20 uL）：DNA模板（浓度25 ng/uL）2 uL，正向引物（浓度10 umol/ul）0.5 uL，反向引物（浓度10 umol/ul）0.5 uL，Mix溶液10 uL，灭菌双蒸水7 uL。PCR扩增条件：首先95 ℃预变性持续15 min；之后94 ℃变性持续30 s，相应退火温度退火持续30 s，72 ℃延伸持续30 s，并设置30个循环；最后72 ℃终止延伸持续10 min。每次扩增过程中均设定阴性对照，每个样品扩增3次。PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后拍照。
微卫星位点 引物序列(5′-3′) 5′端修饰 退火温度/℃ ILSTS004 F: CTTAAAATCTGTCTTTCTTCC 5`6-FAM 48 R:TAGTGTGTATTGGTTTCTCC INRA063 F: ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC 5`HEX 52 R:AAACCACAGAAATGCTTGGAAG OarFCB011 F: GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC 5`6-FAM 54 R:GGCCTGAACTCACAAGTTGATATATCTATCAC ILSTS030 F: CTGCAGTTCTGCATATGTGG 5`HEX 54 R:CTTAGACAACAGGGGTTTGG SR-CRSP-1 F: TGCAAGAAGTTTTTCCAGAGC 5`HEX 54 R:GTACCCTGGTTTCACAAAAGG SR-CRSP-5 F: GGACTCTACCAACTGAGCTACAAG 5`6-FAM 54 R:TTATGAAATGAAGCTAAAGCAATGC ILSTS033 F: TATTAGAGGATGGATGCTAAACT 5`HEX 52 R:CTGCAAATAAGAAAACTGAATAAA OarFCB48 F: GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC 5`HEX 54 R:GACTCTAGAGGTACGCAAAGAACCAG McM038 F: TGGTGAATGGTGCTCTCATACCAG 5`HEX 54 R:CAGCCAGCAGCCTCTAAAGGAC Table 1. Microsatellite DNA markers were used in this study
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使用GeneMarker V2.2.0（Demo）软件，根据DNA片段大小范围和峰形质量确认等位基因。3个重复试验分型一致的结果直接录入数据库，若结果有差异，则需要重新跑PCR甚至重新提取DNA。利用 Excel 2007软件整理所有样品对应微卫星位点的等位基因型数据。
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利用Micro-Checker[22]检验每个位点是否存在无效等位基因或等位基因缺失等情况。利用Genepop on the Web[23]和GenAlEx[24]软件，对每个微卫星位点是否偏离哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）和是否存在连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）进行分析。哈迪-温伯格平衡检测中，若P>0.05，则符合哈代-温伯格平衡，说明这个群体是随机交配群体；若P<0.05，则呈显著偏离哈代-温伯格平衡状态；若P<0.01，则呈极显著偏离哈代-温伯格平衡状态。利用Cervus、GenAlEx、Excel Microsatellite Toolkit统计各个微卫星标记位点的等位基因数（k）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望杂合度（Expected heterozygosity，He）和多态信息含量（Polymorphism information content，PIC）[24, 25]。当PIC<0.25、0.25<PIC<0.5和PIC>0.5时，分别表示该座位为低度、中度和高度多态位点，其中高度多态位点能够提供大量的遗传信息，中度多态位点可以提供较为合理的信息[10, 11, 13, 20, 21, 26]。
1.1. 研究材料
1.2. 研究方法
1.2.1. 基因组DNA提取与检测
1.2.2. 基因分型
1.2.3. 数据分析
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本研究筛选得到的9对多态性微卫星位点中，高度多态标记位点有5对（PIC>0.5），可提供大量的遗传信息，中度多态标记位点有3对（0.25<PIC<0.5），能够提供较为合理的信息，低度多态标记位点仅1对（PIC<0.25），为SR-CRSP-1，可提供的信息量较差（见表2）。9个微卫星标记位点的等位基因数范围是3~7，平均值是4.89；其中，等位基因数是4及以上的微卫星位点有7个，占多态性微卫星位点总数的77.8%；等位基因数在5~7之间的微卫星位点有6个，占多态性微卫星位点总数的66.7%；仅有2个微卫星位点的等位基因数是3个（见表2）。观察杂合度的变异范围是0.250~0.839，平均值是0.547；期望杂合度的变异范围是0.226~0.766，平均值是0.539（见表2）。多态信息含量的变异范围是0.226~0.766，平均值是0.515（见表2）。
依据哈代-温伯格平衡检测中的P值，9个微卫星标记位点中有7个标记位点符合哈代-温伯格平衡，占77.8%；另外2个标记位点（INRA063和SR-CRSP-5）显著偏离哈代-温伯格平衡，占22.2%。
依据连锁不平衡检测结果，9个微卫星标记位点之间均不存在连锁不平衡现象（P>0.001），表明所选用的微卫星标记位点是相互独立的遗传标记系统。
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排除SR-CRSP-1外之后，使用剩余的8个微卫星标记位点对圈养成都麻羊种群进行遗传多样性分析，共有60个等位基因被成功检测，各标记位点的等位基因数介于5~11之间，平均值为7.5；各标记位点的平均有效等位基因数为2.36个；各个位点私有等位基因检测并未发现其存在；观察杂合度的变异范围是0.413~0.770，平均值是0.577；期望杂合度的变异范围是0.493~0.777，平均值是0.634；多态信息含量的变异范围是0.432~0.743，平均值是0.580（见表3）。
微卫星位点 k N Ho He PIC F(Null) ILSTS004 5 31 0.452 0.435 0.404 −0.0615 INRA063 5 31 0.516 0.654 0.598 0.1032 OarFCB011 4 32 0.594 0.629 0.551 −0.0297 ILSTS030 6 32 0.813 0.685 0.633 −0.0991 SR-CRSP-1 3 32 0.250 0.226 0.226 −0.0608 SR-CRSP-5 7 32 0.594 0.591 0.591 −0.0116 ILSTS033 5 29 0.414 0.459 0.459 0.0122 OarFCB48 6 31 0.839 0.766 0.766 −0.0582 McM038 3 31 0.452 0.410 0.410 −0.0721 注：k表示等位基因数，N表示DNA样品量，Ho表示观察杂合度，He表示期望杂合度，PIC表示多态信息含量 Table 2. Polymorphism detection results of 9 microsatellite markers
微卫星标记 k N Ho He PIC HWE F(Null) ILSTS004 11 260 0.565 0.610 0.585 NS 0.0367 INRA063 5 254 0.594 0.675 0.622 NS 0.0579 OarFCB011 8 260 0.531 0.635 0.565 NS 0.0900 ILSTS030 7 267 0.704 0.696 0.656 NS −0.0110 SR-CRSP-5 8 261 0.598 0.614 0.567 NS 0.0063 ILSTS033 7 262 0.443 0.491 0.468 NS 0.0500 OarFCB48 9 256 0.770 0.777 0.743 NS 0.0037 McM038 5 264 0.413 0.493 0.432 NS 0.0815 注：k表示等位基因数，N表示DNA样品量，Ho表示观察杂合度，He表示期望杂合度，PIC表示多态信息含量，HWE表示哈代-温伯格平衡 Table 3. Genetic diversity of captive Chengdu gray goat population
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在8个微卫星标记位点中，等位基因较多的前4个是：ILSTS004，共检测到11个等位基因，大小分布在111~131 bp，频率范围为0.0038~0.6000；OarFCB48，共检测到9个等位基因，大小分布在148~168 bp，频率范围为0.0039~0.3262；SR-CRSP-5，共检测到8个等位基因，大小分布在168~186 bp，频率范围为0.0077~0.5613；OarFCB011，共检测到8个等位基因，大小分布在133~157 bp，频率范围为0.0019~0.4615（见图1）。
Figure 1. Allele frequency of microsatellite markers
在8个微卫星标记位点中，等位基因较少的4个位点是：ILSTS033，共检测到7个等位基因，大小分布在148~166 bp，频率范围为0.0057~0.6985；ILSTS030，共检测到7个等位基因，大小分布在161~175 bp，频率范围为0.0019~0.4775；McM038，共检测到5个等位基因，大小分布在123~139 bp，频率范围为0.0038~0.6629；INRA063，共检测到5个等位基因，大小分布在160~168 bp，频率范围为0.0138~0.4685（见图1）。
2.1. 微卫星位点检测
2.2. 种群遗传多样性分析
2.3. 微卫星标记位点等位基因分布
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遗传多样性是一个物种适应环境变化所必需的条件[7]。种群内的遗传多样性反映了一个物种的进化潜力，是其遗传特征进化的基础[26]。一个物种的遗传变异越丰富，其对自然选择和环境变化的适应能力就越强[6, 9, 12, 27]。遗传多样性通常用等位基因多样性、多态性、平均杂合度等指标来描述[6, 12, 16, 19]。
在同一微卫星位点中，随着核心重复序列重复次数的变化，该位点的片段长度也会发生变化，继而形成等位基因[11, 17]；等位基因是形成群体遗传多态性的基础，等位基因数越多，遗传多态性越丰富[17]。评价位点多态性高低的指标是多态信息含量[17]。本研究从9个微卫星位点中筛选到5个高度多态的位点、3个中度多态性的位点、1个低度多态性的位点，因此仅有前8个可作为有效的分子标记进行群体遗传多样性分析。在后续的分析中我们使用了这8个中高度多态的微卫星位点分析了268份成都麻羊样品，最终在这8个位点中一共检测到的等位基因数为60个，平均等位基因数为7.5，与其他绵羊种群相比，要高于甘肃高山细尾羊、滩羊、藏羊等[7]，低于山东省的小尾寒羊、大尾寒羊、山地绵羊、洼地绵羊等[28]，与四川省布拖黑绵羊种群基本持平[10]，但与其他山羊种群相比，要高于山西黎城大青羊、山西吕梁黑山羊、宁夏中卫山羊、贵州白山羊、云南威信白山羊等[11, 16, 19]，低于湖南湘东黑山羊、重庆川东白山羊、云南云岭山羊、河南黄淮山羊等[11]。不过，这并不能排除种群大小和所用微卫星位点数不同而造成的差异。有研究表明，如果样本量太少，会导致一些频率较低的等位基因无法被检测到，进而对试验结果的准确性造成影响[9]。本研究使用了8个微卫星位点分析了268份成都麻羊样品，微卫星位点数量属于平均水平，种群样本量较大，而个别其他研究的样本量最少仅有20余份[11, 17]，微卫星位点数量最少仅有5个[7, 17]。以同一微卫星位点而言，种群样本量越大，其观察到的等位基因数往往越多，以微卫星位点ILSTS004、OarFCB011和ILSTS030为例，本研究中观察到的等位基因数目分别为11、8和7，而在刘成建的研究中（涉及20个样本量）仅为5和4[17]。此外，在本项研究中，成都麻羊群体中8个微卫星位点的多态信息含量的变异范围是0.432~0.743，平均多态信息含量0.580，与刘成建的研究结果（0.604）基本一致[17]，表明了成都麻羊群体具有较丰富的遗传多样性。
基因杂合度，它反映了群体在几个位点的遗传变异情况，是被检测的遗传标记的多态性的度量参数[10, 17]。若某个群体的基因杂合度大于0.5，则意味着该群体还未受到高强度的选择压力，其遗传多样性比较丰富[10, 17]。在本项研究中，成都麻羊群体的平均观察杂合度和平均期望杂合度分别为0.577和0.634，表明该群体有较丰富的遗传多样性，该结果与前述多态性的分析结果相一致。另外，刘若余等人基于线粒体D-loop序列调查了中国9个山羊品种的遗传多样性，其中成都麻羊的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为1.0000±0.0243和0.017956±0.004410，同样表明其有着丰富的遗传多样性[29]。
有效等位基因数也可以反应群体的遗传变异大小，在数值上等于基因纯合度的倒数[9, 16, 17]。若有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数，则说明等位基因在群体中分布越均匀[9, 16, 17, 21]。本研究中，成都麻羊群体平均有效等位基因数（2.36）低于实际观测到的等位基因数（7.5），说明有些等位基因频率相对较高，而另一些相对较低，等位基因在群体中分布得并不均匀，图1也具体地展示了这一现象，究其原因应该是圈养种群频繁人工选择和一定的近亲繁殖造成的。研究同时发现，成都麻羊群体的观察杂合度和期望杂合度之间差异很小，仅为0.057，这说明就目前而言，成都麻羊群体受外来选择压力和近交繁殖等因素的影响还比较小，群体依旧处于遗传平衡的状态
种群遗传学管理的目的是保持种群的遗传多样性，避免近亲繁殖[30]。如果对一个封闭的小种群不采取任何人工干预措施，最终必将造成近亲交配，进而引发近交衰退。鉴于成都麻羊种群的遗传多样性还比较高，受近亲繁殖等因素影响还较小，具有较高的保种潜力，建议开展全面采样，借助微卫星DNA标记技术，完善个体信息档案，构建起具有完整代表性的成都麻羊种群遗传谱系关系。
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