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小熊猫（Ailurus fulgens）属食肉目动物，特化为以竹子为生，其食谱中竹叶占比约为80%~98%[1,5]，具有突出的科学研究价值[1]。它们主要分布于我国四川、云南和西藏，少数分布于尼泊尔、不丹、缅甸等国，是我国国家Ⅱ级重点保护野生动物，由于它们分布狭窄，数量日趋减少，因而受到国内外学者的关注[2]。从全球来看，中国是小熊猫的集中分布区，约有6400~7600只[3]。第四次全国大熊猫调查显示，各大熊猫分布山系的小熊猫适宜栖息地和第三次大熊猫调查相比面积普遍增长，其中邛崃山系增加3012.93 km2、大相岭山系增加1291.29 km2、小相岭山系增加502.72 km2、凉山山系增加509.17 km2[4]；其中，凉山山系增加面积占凉山山系总面积的10.84%，四川美姑大风顶国家级自然保护区是凉山山系野生小熊猫种群的主要分布区之一[4]。
在不同的地区小熊猫偏爱的竹子种类不同，例如，在卧龙自然保护区，它们主要采食冷箭竹和拐棍竹；在冶勒自然保护区，它们主要采食峨热竹；在马边大风顶自然保护区，它们主要采食大叶筇竹[7]。四川美姑大风顶国家级自然保护区位于四川省凉山彝族自治州美姑县城东北，总面积为50655 hm2，其中核心区31097.5 hm2，缓冲区17185 hm2，实验区2372.5 hm2。保护区属森林生态系统类型自然保护区，主要保护对象为大熊猫、小熊猫等珍稀野生动植物及其栖息环境。保护区属深切割中山地貌类型，地势由西南向东北倾斜，海拔1356~4042 m，垂直高差2686 m[7]。保护区内竹子分布的海拔范围为1356~3770.86 m，该区小熊猫主要采食的竹子有熊竹(Yushania ailuropodina)和冷箭竹(Arundinaria faberi)。其中熊竹分布的面积最大，主要分布于大风顶、维核洛区域，在海拔1356~2820.75 m间生长，面积达16988 hm2[8]，是该保护区小熊猫全年采食的竹种。
近年来对小熊猫的研究主要集中在肠道微生物、行为、繁殖生态学等方面[9]，前人研究发现，食性对调节肠道微生物群的结构和功能起着很重要的作用，进而影响小熊猫的健康状况[10]。竹叶作为竹林健康状况的重要指示器官，是竹子叶围微生物生存繁衍的重要场所，同时也是小熊猫病原微生物入侵的重要载体[5]，进而会影响小熊猫肠道微生物的稳态，甚至是肠道疾病。叶围微生物又可称为叶表微生物、叶面微生物[11]。在全球尺度下，叶围细菌总数多达1026个，其中微生物密度在106至107个·cm−2。叶围微生物是植物微生物组的重要组成部分，其在促进植物生长、保护植物不受外部病原菌侵害及参与植物碳氮循环中起重要作用[12]。影响叶围微生物的因素很多，如CO2含量、大气污染、降雨量等，研究发现CO2对水稻不同生长阶段的叶围细菌群落结构有明显的影响，在灌浆期，群落结构对CO2的反应最为明显[13]。降雨刺激蕨类植物叶围某些细菌种群并改变整个群落结构和活动[14]。海拔、温度和湿度也会对叶围微生物造成影响，在四川栗子坪国家级自然保护区内，随着海拔的升高竹叶叶围细菌多样性和丰富度也在下降，秋季叶围细菌的丰度和多样性高于春季[15]。
因此，本研究以四川美姑大风顶国家级自然保护区的熊竹为研究材料，通过逐月收集竹叶样品和高通量测序技术，探究熊竹叶围细菌的组成、多样性、群落结构的年际变化，揭示叶围微生物年际变化的主要环境影响因素和特点，以期为小熊猫主食竹资源的管理提供参考，为野生小熊猫保护措施的科学制定提供依据。
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于2021年9月至2022年8月在四川美姑大风顶国家级自然保护区，逐月在小熊猫采食的地点采集熊竹竹叶样品，每月收集9~10份，全年共118份样品。收集时用无菌手套采集混合竹叶200g，装入无菌密封袋，立即运回实验室(2h内)，进行叶围微生物的富集，菌泥的洗脱、收集等，收集的菌泥于−80℃保存，以备提取基因组DNA[16]。将获得的菌泥根据 OMEGA Stool DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行菌泥微生物群落总基因组DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的质量，使用NanoDrop2000（美国Thermo Scientific公司）测定DNA浓度和纯度。
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以上述提取的DNA为模板，使用携带Barcode序列的上游引物27F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物533R (5’-TIACCGIIICTICTGGCAC-3’)[17]对16S rRNA基因V1-V3 可变区进行 PCR 扩增，扩增程序如下：95℃ 预变性 3 min，27 个循环（95℃ 变性 30s，55℃ 退火 30s，72℃ 延伸 30 s），然后 72℃ 稳定延伸 10 min，最后在4℃进行保存。每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™ Fluorometer (Promega, USA) 对回收产物进行检测定量，最后利用Illumina公司Miseq PE300平台进行测序。
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使用UPARSE软件(v7.1)，根据97%的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元OTU(Operational taxonomic unit)聚类并剔除嵌合体[18-19]。去除所有样品中注释到的叶绿体和线粒体序列。为了尽量减少测序深度对后续Alpha多样性和Beta多样性数据分析的影响，将所有样本序列数进行抽平。利用RDP classifier (v2.11) 比对Silva 16S rRNA基因数据库(v138)进行OTU物种分类学注释，置信度阈值为97%，并在不同物种分类水平统计每个样本的群落组成[20]。使用mother (v1.30.1)基于OTUs数据计算了Shannon指数和Sobs指数。采用Wilcoxon秩和检验(P<0.05)确定不同月份的多样性指数是否存在显著差异。采用基于加权/未加权UniFrac距离的主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)，比较不同月份间叶围细菌群落结构的异同，并使用 ANOSIM 分析检验其差异性水平[21]。
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所有118个样本共获得优化序列 5 826 775条，平均序列长度451bp。去除叶绿体(Chloroplast)和线粒体(Mitochondria)的序列后，按最小序列数抽平, 得到1305670条细菌16S rRNA有效基因序列。按照97%相似性聚类，共获得3 690个OTUs，12个月份共享652个OTUs(见图1)，占总数OTUs的17.67%。其中11月OTUs最丰富(2524)，8月最低(1458)，其他月份从大到小依次是12月(2408)，2月(2291)，9月(2244)，10月(2185)，1月(2065)，3月(2017)，7月(1877)，6月(1858)，4月(1837)，5月(1661) (见图2)。整体来看，OTU数量从2021年9月份至2022年8月份呈下降趋势，秋季 (9月—11月)和冬季 (12月—2月)小熊猫主食竹熊竹叶围细菌的OTUs高于春季(3月—5月)和夏季(6月—8月)。
图 1 不同月份熊竹叶围细菌共享 OTUs 数量的韦恩图
Figure 1. Venn diagram of phyllosphere bacteria OTUs of Y. ailuropodina among different months
图 2 2021年9月至2022年8月间各月份熊竹叶围细菌OTUs数量
Figure 2. Number of phyllosphere bacteria OTUs of Y. ailuropodina from September 2021 to August 2022
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118个熊竹样品细菌OTUs隶属于 24门，53纲，141目，245科，523属。在门水平上，相对丰度小于1%且在该水平上没有注释结果的细菌归于Others. 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)占绝对优势，其总相对丰度大于85% (见图3)。然后依次是Planctomycetes、放线菌门(Actinobacteria)、Armatimonadota、Deinococcota和厚壁菌门(Firmicutes)等。从不同月份上来看，6月变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最高(81.08%)，5月最低(52.63%)。5月拟杆菌门(Bacteroidota)相对丰度最高(28.46%)，8月最低(6.05%)。2月酸杆菌门(Acidobacteriota)相对丰度最高(19.03%)，7月最低(4.37%)。
图 3 熊竹叶围细菌不同月份在门水平上的相对丰度(%)
Figure 3. Relative abundance of Y. ailuropodina phyllosphere bacteria at the phylum level among different months
在属水平上，将相对丰度小于5%且该水平没有注释结果的细菌归于Others后发现，假单胞菌属、1174-901-12属、嗜酸菌属(Acidiphilium)、薄层菌属(Hymenobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为优势属，然后依次是Terriglobus属、Granulicella属、Unclassified-f-Acetobacteraceae、Methylocella属(见图4)。从不同月份看，其中6月假单胞菌属相对丰度最高(50.55%)，4月最低(0.71%)；3月的1174-901-12相对丰度最高(24.39%)，7月最低(3.55%)；5月的嗜酸菌属(Acidiphilium)相对丰度最高(20.39%)，7月最低(2.35%)。
图 4 熊竹叶围细菌不同月份在属水平上的相对丰度(%)
Figure 4. Relative abundance of Y. ailuropodina phyllosphere bacteria at the genus level among different months
上述结果表明，全年12个月份的优势门都为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)，且6—8月变形菌门(Proteobacteria)相对丰度高于其他月份，但是拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度低于其他月份。6—8月假单胞菌属的相对丰度明显高于其他月份，但是6—8月1174-901-12的相对丰度低于其他月份。
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整体上看，从2021年9月份至2022年8月份熊竹叶围细菌Sobs指数呈现下降趋势，但是不同月份之间无显著差异(见图5)。11月份的Sobs指数最高，6月最低，秋季 (9月—11月)和冬季 (12月—2月)叶围细菌Sobs指数大于春季(3月—5月)和夏季(6月—8月) (见图5)。就Shannon指数而言，不同月份之间无显著差异，与Sobs指数结果相似，整体呈下降趋势，其中11月的Shannon指数最高，6月最低 ，秋季 (9月—11月)和冬季 (12月—2月)叶围细菌Shannon指数大于春季(3月—5月)和夏季(6月—8月) (见图6)。根据上述结果可以发现，秋季 (9月—11月)和冬季 (12月—2月)叶围细菌的丰富度和多样性均高于春季(3月—5月)和夏季(6月—8月)。
图 5 基于OTU水平的熊竹叶围细菌Sobs index的年际变化
Figure 5. Interannual variation of Sobs index of Y. ailuropodina phyllosphere bacteria at OTU level.
图 6 基于OTU水平的熊竹叶围细菌Shannon index的年际变化
Figure 6. Interannual variation of Shannon index of Yushania ailuropodina phyllosphere bacteria at OTU level.
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PCoA 分析(Principal coordinates analysis)是群落β多样性分析中常用的一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究样本群落组成的相似性或差异性。基于OTU水平unweighted Unifrac距离的PCoA分析矩阵数据发现，11月份群落距离显著低于其他月份(见图7)；而基于weighted Unifrac距离矩阵数据，10和11月显著低于6—8月(见图8)。在基于unweighted Unifrac距离，仅考虑OTUs的存在或缺失，11月份叶围细菌的群落结构与其他月份存在显著差异的距离。但是基于weighted Unifrac距离，考虑了OTUs的相对丰度时，11月份群落结构与其他月份间的距离缩小，表明11月份的OUTs相对丰度会影响叶围微生物的群落结构。特别的是，与unweighted Unifrac距离相比，秋季(9—11月)、春季(3—5月)和冬季(2021年12月—2022年1月)的距离更近，夏季(6—8月)的weighted Unifrac距离显著大于其他月份，表明夏季(6—8月)的群落结构与其他季节有一定的差异，秋季(9—11月)、春季(3—5月)和冬季(12—1月)的群落结构更相似。
图 7 熊竹叶围细菌不同月份的unweighted UniFrac 距离的年际变化(Mann-Whitney U test, P<0.05)
Figure 7. Interannual variation of bacterial unweighted Unifrac distances in Y. ailuropodina phyllosphere (Mann–Whitney U test, P<0.05）
图 8 熊竹叶围细菌不同月份的weighted UniFrac 距离的年际变化(Mann-Whitney U test, P<0.05)
Figure 8. Interannual variation of bacterial weighted Unifrac distances in Yushania ailuropodina phyllosphere (Mann–Whitney U test, P<0.05）
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12个月份共享652个OTUs，占总数OTUs的17.66%，其中9—12月的OTUs数大于其他月份，表明可能是由于秋冬季节为非雨季节，雨量显著低于春夏季，无显著的雨水冲刷有利于叶围细菌的富集生长；另外，秋冬季节山区的低温也有利于叶围微生物细胞的保存[21,22]。有研究者发现大熊猫主食竹叶围微生物的丰度秋季显著大于春季，与本研究的结果一致[23]。
变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)占绝对优势，其总相对丰度大于85%，该结果与大熊猫主食竹叶围细菌研究结果一致[23-25]。有益的叶围细菌具有多种生物学作用，如平衡植物激素、调节根系生长、促进营养吸收、防止疾病入侵[26]。此外，变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroides)经常在各种森林环境微生物中被发现，这表明这些细菌具有广泛的生态范围和适应性[27]。
在属水平上，相对丰度大于5%的属分别是假单胞菌属、1174-901-12属、嗜酸菌属(Acidiphilium)、薄层菌属(Hymenobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Terriglobus、Granulicella、Unclassified_f__Acetobacteraceae、Methylocella等。其中6—8月的优势属为假单胞菌属，与前人的研究发现夏季竹叶的优势属为假单胞菌属(Pseudomonas)一致[28]，假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)以能在逆境胁迫中生长而著称，是植物叶表的有益菌[28]。其他月份的优势属为1174-901-12属和嗜酸菌属(Acidiphilium)，这说明不同月份的优势属不同，这可能与植物的生理状态和季节气候变化有关[20]。通过改善叶围微生物生态环境来促进植物生长，并且从植物生长微环境中筛选出具有良好促生和抗菌作用的有益菌群是植物保护方面的重要研究领域，例如，假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，已日益被越来越多的科研工作者列为重点研究领域[29]。
动物宿主的健康依赖于肠道微生物，而肠道微生物群既是有益菌群的储存库也是有害菌群的储存库，而食物微生物是动物肠道微生物的重要来源。本研究表明，熊竹叶围细菌的优势菌为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroides)，这些菌群也广泛分布于小熊猫的肠道微生物中[24]，叶围微生物中这些主要菌群的变化可能也会引起小熊猫肠道微生物群落结构的变化，进而影响小熊猫的健康状况。因此，在其他时间也应该密切关注和检测这些优势菌群的分布情况。
不同月份的Sobs指数和Shannon指数组间差异分析发现，秋季 (9月—11月)和冬季 (12月—2月)熊竹叶围细菌的丰富度和多样性高于春季(3月—5月)和夏季(6月—8月)，且秋季的 Sobs指数和Shannon指数最高。这一结果与前人研究黑皮油松叶围微生物的季节性变化的结果相似，该研究发现黑皮油松叶围微生物丰富度在不同季节间差异显著，秋季多样性和丰度最大[30]。此结果表明季节性气候可能是驱动叶围细菌多样性变化的重要因素，秋季叶围细菌丰度和多样性高于其他季节可能是因为少雨且温度逐渐变低所致，更有利于微生物附着在叶表面[21]。
基于(un)weighted UniFrac距离的PCoA分析显示，熊竹叶围细菌群落结构在不同月份间存在一定的差异，夏季(6—8月)群落结构与其他季节群落结构距离较远，春冬季距离更近。再次说明了叶围细菌在不同时间内存在差异[31]。这一结果可能生长环境的雨水、温度改变有关，前人研究温度对土壤微生物群落结构的影响时发现，增温会改变土壤微生物的群落结构[32]。春季和冬季的温度较低有利于菌落细胞的保存，对群落结构的影响较小，所以春冬季节的群落结构更相似，因此与夏季的群落结构距离较远。
保护小熊猫主食竹资源是保护小熊猫等以竹为食的动物的一种重要手段，在四川美姑大风顶国家级自然保护区内熊竹的分布范围最大且是小熊猫主要采食的竹种，因此研究小熊猫主食竹—熊竹就尤为关键。本研究表明，熊竹叶围细菌菌群中变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroides)占优势，这些细菌也是小熊猫肠道微生物中的优势菌群，因此这些细菌优势度的变化可能对凉山山系小熊猫肠道健康产生潜在的影响。假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是良好促生和抗菌作用的有益菌群。因此，在其他时间也应该密切检测这些有益菌群的分布情况，以期可以动态了解小熊猫的健康状况。以上研究结果有助于了解不同月份间熊竹的叶围细菌菌群的差异性，为小熊猫主食竹资源的保护和科学管理提供参考依据。
Interannual Variation of Bacteria Communities in Red Pandas Foraging Bamboos Phyllosphere
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摘要: 竹叶作为竹林健康状况的重要指示器官，是竹子叶围微生物生存繁衍的重要场所，同时也是病原微生物入侵的重要入口，进而会影响野生小熊猫的健康状况。为了探究野生小熊猫主食竹叶围细菌的年际变化，本文以四川美姑大风顶国家级自然保护区的熊竹(Yushania ailuropodina)为研究对象，通过高通量测序技术探究了熊竹叶围细菌组成、多样性、群落结构的年际变化。研究发现，熊竹叶围细菌11月份OTUs最丰富，且OTUs丰富度秋冬季高于春夏季。12个月份的优势门均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)，夏季(6月—8月)的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度高于其他月份，但拟杆菌门的相对丰度低于其他月份。夏季(6月—8月)假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度明显高于其他月份，但1174-901-12的相对丰度低于其他月份。秋季 (9月—11月)和冬季 (12月—2月)小熊猫主食竹熊竹叶围细菌的丰富度(Sobs index)和多样性(Shannon index)高于其他季节；群落结构(un)weighted Unifrac distances在不同月份间存在一定的差异，其中夏季(6月—8月)的weighted Unifrac距离显著大于其他月份。本研究表明小熊猫主食竹叶围微生物丰富，其组成、多样性、群落结构具有明显的年际变化规律，且主要受季节的影响。本研究可为小熊猫主食竹资源的科学管理提供支撑，为野生小熊猫保护措施的科学制定提供参考依据。Abstract: As an important indicator organ of bamboo forest health, bamboo leaves are an important place for the survival and reproduction of microorganisms around bamboo leaves, as well as an important entrance for pathogenic microorganisms to invade, which will affect the health of wild red pandas. In order to investigate the interannual variation of bacteria communities in red pandas foraging bamboos phyllosphere, high-throughput sequencing was used to analyze the composition and diversity of phyllosphere bacteria of Yushania ailuropodina in Sichuan Meigu Dafengding National Nature Reserve. The results showed that OTUs was most abundant in November, and the number of OTUs decreased from September 2021 to August 2022. Proteobacteria, Bacteroidota and Acidobacteriota were the predominant phyla in whole 12 months, and the relative abundance of Proteobacteria in June, July and August was higher than that in other months. But the relative abundance of Bacteroidota was lower than that of other months. The relative abundance of Pseudomonas in June, July and August was significantly higher than that in other months, but the relative abundance of Pseudomonas and 1174-901-12 in June, July and August was lower than that in other months. The Sobs and Shannon index of phyllosphere bacteria in September, October and November were higher than those in other months. PCoA analysis based on weighted/unweighted UniFrac distance showed that the bacterial community structure of phyllosphere bacteria varied from different months at OTU level. This study improved our understanding of phyllosphere bacteria in red pandas foraging bamboos, and provided a reference for the protection of bamboo resources.
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图 1 不同月份熊竹叶围细菌共享 OTUs 数量的韦恩图
Fig. 1 Venn diagram of phyllosphere bacteria OTUs of Y. ailuropodina among different months
图 2 2021年9月至2022年8月间各月份熊竹叶围细菌OTUs数量
Fig. 2 Number of phyllosphere bacteria OTUs of Y. ailuropodina from September 2021 to August 2022
图 3 熊竹叶围细菌不同月份在门水平上的相对丰度(%)
Fig. 3 Relative abundance of Y. ailuropodina phyllosphere bacteria at the phylum level among different months
图 4 熊竹叶围细菌不同月份在属水平上的相对丰度(%)
Fig. 4 Relative abundance of Y. ailuropodina phyllosphere bacteria at the genus level among different months
图 5 基于OTU水平的熊竹叶围细菌Sobs index的年际变化
Fig. 5 Interannual variation of Sobs index of Y. ailuropodina phyllosphere bacteria at OTU level.
图 6 基于OTU水平的熊竹叶围细菌Shannon index的年际变化
Fig. 6 Interannual variation of Shannon index of Yushania ailuropodina phyllosphere bacteria at OTU level.
图 7 熊竹叶围细菌不同月份的unweighted UniFrac 距离的年际变化(Mann-Whitney U test, P<0.05)
Fig. 7 Interannual variation of bacterial unweighted Unifrac distances in Y. ailuropodina phyllosphere (Mann–Whitney U test, P<0.05）
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