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手参（Gymnadenia conopsea）藏药名为旺拉，又名佛手参、手掌参等。据《藏药标准》记载，手参味甘，性平，具有补益气血、生津止渴、收敛止血、壮阳等功效，常用于治疗身体虚弱、脾虚咳嗽、久泻止血、阳痿等疾病[1]。现代药理研究发现，手参具有抗过敏、延缓衰老、促进细胞增殖、免疫调节、神经保护、血管舒张等诸多活性[2]。作为一种药食两用的植物，手参也被广泛使用于保健食品领域，具有很大的开发前景和营养价值。现代研究表明，手参药材主要含有苷类、菲类、二氢芪类、芳香族类化合物，如天麻素、Dactylorhin、Militarine[3-4]。此外，还含有酚酸类、醚类、醛类和甾醇类等成分[5]。目前，已有文献采用色谱技术测定了手参中对羟基苯甲醇和天麻素类成分的含量[6-7]。然而，没有对多类成分同时进行检测分析的研究报道，这显然不符合中药多成分、多靶点的整体性特点。因此，本研究首次采用体现整体性的氢核磁共振（1H-NMR）代谢组学技术，同时检测分析其初生和次生代谢产物，建立整体1H-NMR指纹图谱，结合PCA化学计量学方法，从代谢物组水平上系统分析了不同产地手参药材的初生和次生代谢产物差异，从而对不同产地手参药材的质量进行整体评价，以期筛选出优质手参的产地，为手参药材的人工种植、品种选育、质量控制和开发利用提供参考依据。
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布鲁克Bruker700MHz核磁共振波谱仪；KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；W201型恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）；Sartorius BP221S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。
氘代甲醇（CD3OD，99.8%）和重水（D2O，99.9%）均购自四川赛因斯特生物科技有限公司；3-(三甲基硅基)-2,2,3,3-四氘代丙酸钠盐（TSP）购自Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA)；分析级磷酸二氢钾（KH2PO4）购自成都市科龙化工试剂厂；天麻素（批号：DST191013-013）、Dactylorhin（批号：DST200901-233）、对羟基苯甲醇（批号：DST191016-123）、对羟基苯甲醛（批号：DST200513-129）、Militarine（批号：DST200622-025）对照品均购自成都德斯特生物技术有限公司，纯度均大于98%。
2019年8月，共收集了16批来自四川省甘孜州不同产地的手参药材，鉴定结果均为兰科植物手参Gymnadenia conopsea。采集后先除去泥土杂质，及时放在日光下晒干，分别置于干燥阴凉处保藏，选取手参干燥块茎作为试验样品，样品信息见表1。
表 1 不同产地手参药材的来源
Table 1. Origins of Gymnadenia conopsea from different regions
编号 来源 海拔/m 东经 北纬 GC-1 色达县泥朵镇棒须村 4 143 99°46′5.59″ 32°37′11.49″ GC-2 色达县大则乡汪扎村 4 020 100°7′53.43″ 32°16′14.02″ GC-3 泸定县燕子沟镇燕子沟 2 344 102°2′0.31″ 29°41′44.50″ GC-4 泸定县燕子沟镇雅加埂 3 229 102°2′33.60″ 29°47′45.57″ GC-5 理塘县濯桑乡业务村 3 792 100°20′10.95″ 29°43′13.97″ GC-6 理塘县奔戈乡卡灰村 3 893 100°18′0.25″ 29°54′23.91″ GC-7 新龙县甲拉西乡依西村 3 580 100°19′16.03″ 30°53′42.09″ GC-8 新龙县拉日马镇泽龙多村 3 973 100°37′21.43″ 30°52′7.49″ GC-9 炉霍县仁达乡格色村 3 456 100°43′5.03″ 31°10′16.81″ GC-10 乡城县香巴拉镇冷龙村山 4 040 99°45′9.12″ 28°57′17.87″ GC-11 德格县窝公乡拉绒村 4 301 99°2′15.08″ 32°1′30.58″ GC-12 石渠县长沙贡马乡查拉村 4 233 97°58′7.99″ 33°26′1.96″ GC-13 甘孜县查龙镇查龙一村 3 853 99°44′13.35″ 32°12′52.49″ GC-14 甘孜县茶扎乡银多村 4 229 99°42′38.73″ 32°1′43.65″ GC-15 康定市塔公镇下马龙村 3 806 101°34′2.45″ 30°18′33.95″ GC-16 道孚县八美镇河垭村 3 507 101°29′15.87″ 30°30′18.58″ -
以氘代甲醇为频率内锁，测定条件如下：观察频率700.20 MHz，测定温度T = 25 ℃，采样次数Number of Scans = 64，脉冲延迟时间Relaxation Delay = 4.0 s，谱宽Spectral Width = 11 363.6 Hz，采样时间Acquisition Time = 1.4418 s，脉冲宽度Pulse Width = 10.87 μs，采用标准的预饱和脉冲序列(ZGPR)压制水峰信号。
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主要采用“加标准品定性试验”及对比文献数据进行信号归属，将测得的1H-NMR自由感应衰减信号导入MestReNova (version 7.0)软件进行傅立叶转换，并手动调整相位和基线，以TSP（0 mg·L–1）为基准校正化学位移[8]。针对0.50~9.80 mg·L–1范围的图谱以0.002 mg·L–1为化学位移值单位进行分段积分(binning)，然后以总峰面积进行归一化处理，再以ASCII格式输出数据，得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值，最后将获得的数据矩阵导入SIMCA-P软件(version 11.5)，数据采用Center方法进行尺度同一化处理，预处理后的数据再进行主成分分析（PCA），以评价不同产地手参药材的质量差异。
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本试验共得到4 650段积分，扣除23段属于甲醇溶剂的信号(3.280~3.326 mg·L–1)和200段残留水峰的信号(4.65~5.05 mg·L–1)，最终获得4 427段数据，代表4427个变量进行多变量统计与分析。本研究从手参药材提取物中共鉴定出14种化合物，包括天麻素、dactylorhin、militarine、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、醋酸、丁二酸、甲酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸，同时发现含有饱和脂肪酸类、不饱和脂肪酸类和甾醇类成分（手参药材代表性的一维1H-NMR谱见图1）。由于1H-NMR是一种代谢组学分析技术，强调的是整体分析，无法准确测定每一个成分的绝对含量，但可以通过峰面积代表相对含量进行组间比较，图3展示了不同产地手参药材中几个主要代谢成分的相对含量差异。
图 1 手参提取物代表性的1H-NMR图谱
Figure 1. Representative 1H-NMR spectra of Gymnadenia conopsea extracts
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通过主成分分析发现，天麻素、dactylorhin、militarine、对羟基苯甲醇、丙氨酸和不饱和脂肪酸类可能是引起不同产地手参的主要差异代谢物。PCA的得分图见图2，每一个投影点代表一个样品，样品编号对应表1，前2个主成分的累积贡献率为98.4%（PC1 = 94.2%，PC2 = 4.2%），由第一主成分（PC1）与第二主成分（PC2）的得分图可知，不同产地的手参药材主要沿着PC1轴分为两大类，GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10聚为一类，GC-11、GC-12、GC-13、GC-14、GC-15、GC-16聚为另外一类，表明不同产地药材的质量存在一定的差异。
图 2 不同产地手参药材的PCA得分图
Figure 2. PCA score plot of Gymnadenia conopsea from different regions
通过对鉴定的17种成分的归一化峰面积进行组间t检验统计分析，结果表明（见图3），与GC-11、GC-12、GC-13、GC-14、GC-15、GC-16比较，PCA分析聚为另一类的（GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10）手参药材含有明显更多的天麻素、dactylorhin、militarine、对羟基苯甲醇、丙氨酸和不饱和脂肪酸类成分（P< 0.05），而其他11种成分在不同产地间没有显著性差异。现代研究表明，天麻素、dactylorhin、militarine和对羟基苯甲醇为手参药材的主要活性成分，因此GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10产地的手参药材有更好的质量。
图 3 不同产地手参药材中主要代谢成分的表达水平比较
Figure 3. Comparison of the expression levels of main metabolites in Gymnadenia conopsea from different regions
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总体上看，本研究采用体现整体性的1H-NMR代谢组学技术，检测分析了手参药材的整体化学成分信息，鉴定了包括苷类、糖类、有机酸类及氨基酸类等初级和次级代谢产物在内的14种化合物，包括天麻素、dactylorhin、militarine、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、醋酸、丁二酸、甲酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸，同时发现含有饱和脂肪酸类、不饱和脂肪酸类和甾醇类成分，建立的1H-NMR图谱为手参药材的质量控制与评价提供了新的技术手段。同时，结合主成分分析发现不同产地手参的差异代谢标志物主要为天麻素、dactylorhin、militarine、对羟基苯甲醇、丙氨酸和不饱和脂肪酸，结果表明GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10产地的手参药材的质量更好。
国内外各类研究和本研究均表明，手参药材的主要活性成分在不同产地的样品间含量差异较大，不同产地的手参药材质量可能存在较大的差别，但造成这些差别的主要原因尚未被揭示，本研究从海拔梯度来看，不同产地手参的主要代谢产物的含量没有变化规律，今后应进一步深入研究不同产地手参存在差异代谢产物的原因，以促进当地手参资源的开发利用。
Study on Quality Evaluation of Gymnadenia conopsea from Different Regions Based on 1H-NMR Metabolomics
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摘要: 本研究共收集了16批手参药材样本，采用氢核磁共振（1H-NMR）代谢组学技术，建立手参药材的整体1H-NMR指纹图谱，并结合主成分分析（PCA）等化学计量学方法，从代谢物组水平上系统分析了不同产地手参药材的初生和次生代谢产物差异，从而对不同产地手参药材的质量进行了整体评价。通过比较发现，GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10产地的手参药材有更好的质量，研究建立的1H-NMR图谱为手参药材的质量控制与评价提供了新的技术手段，研究结果为手参药材的人工种植、品种选育、质量控制和开发利用提供参考依据。
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关键词:
- 手参;
- 1H-NMR代谢组学;
- 质量评价
Abstract: In this study, sixteen samples of Gymnadenia conopsea were collected, and the fingerprints of Gymnadenia conopsea were established using 1H-NMR metabonomics technology. Combined with principal component analysis (PCA) and other chemometrics methods, the differences of primary and secondary metabolites of Gymnadenia conopsea from different regions were systematically analyzed at metabolome level, and the quality of Gymnadenia conopsea from different regions was entirely evaluated. By comparison, the results indicated that GC-1, GC-2, GC-3, GC-4, GC-5, GC-6, GC-7, GC-8, GC-9 and GC-10 had higher quality, and the established 1H-NMR spectrum provided a new technical method for the quality control and evaluation of Gymnadenia conopsea. The results provide reference for the cultivation, breeding, quality control development and utilization of Gymnadenia conopsea.-
Key words:
- Gymnadenia conopsea;
- 1H-NMR metabolomics;
- Quality evaluation
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图 1 手参提取物代表性的1H-NMR图谱
A.低场区；B.中场区；C.高场区;信号归属：1. 天麻素；2. dactylorhin；3. militarine；4. 对羟基苯甲醇；5. 对羟基苯甲醛；6. 蔗糖；7. α-葡萄糖；8. β-葡萄糖；9.醋酸；10.丁二酸；11.甲酸; 12. 谷氨酸；13. 丙氨酸；14. 缬氨酸；15. 饱和脂肪酸类；16. 不饱和脂肪酸类；17. 甾醇类。
Fig. 1 Representative 1H-NMR spectra of Gymnadenia conopsea extracts
A. Low field area; B. Middle field area; C. High field area; Signal attribution: 1. Gastrodin; 2. Dactylorhin; 3. Militarine; 4. P-hydroxybenzyl alcohol; 5. P-hydroxybenzaldehyde; 6. Sucrose; 7. α- glucose; 8. β- glucose; 9. Acetic acid; 10. Succinic acid; 11. Formic acid; 12. Glutamic acid; 13. Alanine; 14. Valine; 15. Saturated fatty acids; 16. Unsaturated fatty acids; 17. Sterols
图 2 不同产地手参药材的PCA得分图
Fig. 2 PCA score plot of Gymnadenia conopsea from different regions
图 3 不同产地手参药材中主要代谢成分的表达水平比较
Fig. 3 Comparison of the expression levels of main metabolites in Gymnadenia conopsea from different regions
(*P< 0.05, **P< 0.01)
表 1 不同产地手参药材的来源
Tab. 1 Origins of Gymnadenia conopsea from different regions
编号 来源 海拔/m 东经 北纬 GC-1 色达县泥朵镇棒须村 4 143 99°46′5.59″ 32°37′11.49″ GC-2 色达县大则乡汪扎村 4 020 100°7′53.43″ 32°16′14.02″ GC-3 泸定县燕子沟镇燕子沟 2 344 102°2′0.31″ 29°41′44.50″ GC-4 泸定县燕子沟镇雅加埂 3 229 102°2′33.60″ 29°47′45.57″ GC-5 理塘县濯桑乡业务村 3 792 100°20′10.95″ 29°43′13.97″ GC-6 理塘县奔戈乡卡灰村 3 893 100°18′0.25″ 29°54′23.91″ GC-7 新龙县甲拉西乡依西村 3 580 100°19′16.03″ 30°53′42.09″ GC-8 新龙县拉日马镇泽龙多村 3 973 100°37′21.43″ 30°52′7.49″ GC-9 炉霍县仁达乡格色村 3 456 100°43′5.03″ 31°10′16.81″ GC-10 乡城县香巴拉镇冷龙村山 4 040 99°45′9.12″ 28°57′17.87″ GC-11 德格县窝公乡拉绒村 4 301 99°2′15.08″ 32°1′30.58″ GC-12 石渠县长沙贡马乡查拉村 4 233 97°58′7.99″ 33°26′1.96″ GC-13 甘孜县查龙镇查龙一村 3 853 99°44′13.35″ 32°12′52.49″ GC-14 甘孜县茶扎乡银多村 4 229 99°42′38.73″ 32°1′43.65″ GC-15 康定市塔公镇下马龙村 3 806 101°34′2.45″ 30°18′33.95″ GC-16 道孚县八美镇河垭村 3 507 101°29′15.87″ 30°30′18.58″ 
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