薇甘菊病叶采自化州市良光镇长安村，薇甘菊覆盖桉树及橡胶林地边缘围园灌木，部分攀爬桉树及橡胶树，微甘菊新叶叶斑病发生率35%～65%，按常规方法对病害症状进行描述，并拍照。多点采集具备典型症状的叶片，保湿带回实验室，采样时间为2018年4月至5月，晴天下午采样，共采样3次，每次采集叶片10片。

采用常规病原体分离法进行分离^[6]，共分离50皿150个叶片组织块。对所分离出的真菌菌落采用琼脂平板稀释纯化法进行纯化^[7]，并将纯化菌株转入试管斜面，保存于4 ℃冰箱内。

将1.2纯化的菌株共7株接到PDA培养基上，置于自然光照培养室25 ℃±1 ℃培养2 d，在无病薇甘菊叶片中央采用无伤离体接种菌丝块，每片叶接种1个直接0.4 cm菌饼，并以接种无菌PDA培养基为对照，参试菌株7个，每个处理重复3次，每个重复接种5片叶片，保湿并室温培养，观察发病情况。若接种叶片发病则再分离，完成柯赫法则验证。

将病原菌（1.3回接发病的菌株共1个）接种于PDA培养基上，置于自然光照培养室25 ℃±1 ℃培养3 d，观察病原菌菌落形态、产孢情况、产孢结构和孢子形态并测量拍照。

病原菌分子鉴定方法参照郑樊^[8]。

根据华南地区气温及病害发病规律，设置15、21、24、27、30、33、36及42 ℃等8个温度值进行菌丝生长试验。使用直径0.4 cm菌饼接种，培养5 d后用十字交叉法测定菌落直径，比较温度对病原菌菌丝生长的影响。

寄主范围测定以本地主栽农作物、水果和经济作物作为参试物，包括水稻、木薯、香蕉、龙眼、芒果、桉树、橡胶、甘蔗和桑树等。以菌丝段悬浮液喷雾无伤活体接种，将直径10 cm培养皿长满菌丝的培养基取出，加水200 mL，使用料理机打碎，过滤，加水定容为500 mL，即得接种用菌丝段悬浮液，傍晚喷雾，每个参试作物接种3次，每次喷雾5个接种点，完全喷湿接种部位叶片表面，喷雾后5 d，观察记录发病情况，包括病斑形状、大小、颜色、深度和病征，如出现侵染，在接种后15 d，观察是否出现未喷雾叶片感染，即是否出现再侵染。

薇甘菊叶斑病能入侵薇甘菊，使叶片、叶柄及未老化茎产生病变，初期为黄褐色点状病斑（见图1A），后逐渐扩大，近圆形或沿叶脉、侧脉扩展成不规则形病斑，病斑中央植物组织易失去水分而干枯、变薄、易裂、穿孔（见图1B和C）。叶柄及枝条的病斑初期为褐色小点、略凹陷，后期不断扩大呈长条形褐色病斑，直至环绕枝条一圈。病叶保湿情况下，肉眼或用放大镜观察未见小黑点等其他病症。

图  1  薇甘菊叶斑病症状

Figure 1.  Symptoms of Mikania micrantha leaf spot

分离纯化菌株回接只有1个致病，其余菌株和对照不发病。接种后第3天症状开始出现（见图2A），发病初期接种点呈黑色坏死，病健交界明显，随后病斑继续扩展，初期发病部位组织坏死分解（见图2B），将该菌菌落活体接种至薇甘菊无菌苗，表现为叶片及茎段发病，与田间观察到的症状相似（见图2C）。

图  2  病原菌致病性测定

Figure 2.  Pathogenicity test of pathogenic bacteria

培养性状及形态在PDA上菌落圆形，边缘未老熟菌丝白色，老熟后菌丝呈黄色，菌落整体颜色初期白色后变黄褐色至深褐色（见图3A）。在PDA上不产孢，将菌丝接种于薇甘菊无菌苗可产生分生孢子器和分生孢子。

图  3  病原菌形态特征

Figure 3.  Morphological characteristics of pathogenic bacteria

分生孢子器黑色、扁球形至球形（见图3 C和D），直径60.2~185.3 μm×72.8~159.2 μm，分生孢子椭圆形到卵圆形，无色，单胞，顶端钝圆（见图3 B），分生孢子大小：3.9~7.1 μm×1.3~3.2 μm。

通过ITS对引物对菌株进行PCR扩增、测序，得到长度分别为516 bp的序列。将得到的序列在GenBank中进行比对，并构建系统发育树，经MEGA7.0软件进行系统发育分析，系统发育树的各个分支的支持强度通过1 000次重复的自展检验数值进行评估。结果发现，菌株（WGJ）与Boeremia exigua聚为一个进化枝（见图4），支持率为100%。依据形态鉴定和系统发育分析，叶斑病病原菌经鉴定为Boeremia exigua。

图  4  基于ITS序列构建ML系统发育树

Figure 4.  Construction of ML phylogenetic tree based on ITS sequences

试验结果看出，15~27 ℃范围内，该病原菌菌落直径随温度升高逐渐增大；27~42 ℃范围内，菌落直径随温度升高逐渐减小。菌丝生长适宜温度为24~33 ℃，最适温度27 ℃，42 ℃时菌丝不能生长，菌落直径与接入菌饼直径相同（见图5）。

图  5  温度对菌丝生长的影响

Figure 5.  Effect of temperature on mycelia growth

经菌丝段悬浮液喷雾接种，除桑树出现少量病斑，其余参试作物均未出现被侵染症状（见表1）。

由表1可知，所有参试作物，均未出现致死，仅桑树轻度发病，并未发现再侵染。

经过对叶斑病的诊断和病原菌形态观察测定，包括分生孢子器形态，分生孢子形状、分生孢子大小，根据鉴定结果查阅相关资料^[9]，初步鉴定薇甘菊叶斑病病原菌为Boeremia属真菌，依据形态鉴定和系统发育分析，叶斑病病原菌经鉴定为大豆茎点霉Boeremia exigua。病原菌菌丝生长适宜温度为24~33 ℃，最适温度27 ℃，与野外观测发生季节一致。

病原菌寄主范围测定显示可侵染桑树，韦海玲报道Boeremia exigua可致桑断枝烂叶病^[10]，本研究接种未发现再侵染，具体原因有待进一步研究。王梦奇报道，Boeremia exigua可导致大豆茎点霉叶斑病^[11]，但大豆非本地主要作物，未开展试验。本研究过程中在使用菌丝悬浮液喷洒薇甘菊过程中，薇甘菊宿主团花树（Neolamarckia cadamba(Roxb.)Bosser）出现叶斑症状，亦无再侵染现象发生。

谷祖敏报道草茎点霉(Phoma herbarum )具备作为生物除草剂防除鸭跖草的潜力，且生物安全性良好和环境安全性良好^[12]。Marcinkowska J认为，Boeremia exigua为多主寄生真菌，无寄主专化现象^[13]。本研究对本地主要农作物等开展的寄主范围测定结果显示，大豆茎点霉寄主选择性较好，具备进一步开展生物除草剂研究的潜力。